论文部分内容阅读
目的：建立一种检测核膜核苷三磷酸酶（nucleoside triphosphatase，NTPase，EC 3.6.1.15）的方法，并利用大鼠主动脉内皮剥脱术后再狭窄模型，探讨内皮剥脱术后不同时间血管壁核膜NTPase活性变化及其与血管平滑肌细胞（vascular smooth musclecell，VSMC）物质代谢及细胞增殖的关系。 方法： 1．核膜NTPase测定方法的建立：（1）大鼠主动脉细胞核的提取：大鼠处死后立即取血管，刮除血管内皮后，用STM缓冲液匀浆，过滤，离心，沉淀的细胞核重悬于DS缓冲液，离心，加入裂解缓冲液，离心，取上清液测定NTPase活性。（2）核膜NTPase活性的测定：用722型分光光度计在820nm处比色测定反应产生的无机磷（Pi）。以不同浓度的KH2PO4做标准磷液，酶活性用nmolPi·mg-1Pr·min-1表示。由于刮除内皮的血管中，主要的细胞成分是VSMC，因此，本实验方法测得的NTPase活性可以反映正常及主动脉内皮剥脱后血管壁VSMC中的NTPase活性变化。 2．主动脉内皮剥脱模型的建立及分组：将SD大鼠随机分为5组，每组6只，对照组，3天组，7天组，14天组，21天组。分别于手术后3d、7d、14d、21d取大鼠 中文摘要胸腹主动脉损伤部位血管段进行形态学观察和 NTPase活性及相关指标的测定。 3．主动脉平滑肌 a－肌动蛋白oM a《ctin)和骨桥蛋白bsteopontin，OPN)Western印迹分祈：取对照组、主动脉内皮剥脱术后3天、7天、14天、ZI天的大鼠主动脉蛋白提取液进行SDS－PAGE。电印迹转至硝酸纤维素膜上，随后与一抗、h抗进行结合反应，Western印迹结果用美国 Kodak公司 ID数码成像分析系统软件进行定量分析。 4．主动脉 5’－核昔酸酶（5’－nucleotidase，5’－NT EC3．l．3．5）、腺昔脱氨酶（adenosine de删Inase，ADA，EC3．5．4．4）和琉琅酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH，EC．3．99＊）活性的测定：大鼠主动脉匀浆后的上清用于测定 5’－NT和 SDH的活性，主动脉细胞核提取液用于测定ADA的活性。 结果： 1．核膜NTPase测定方法的建立：根据NTPase水解核昔三磷酸生成的无机磷可与钥酸作用生成磷钥酸，后者可被还原剂还原成钥蓝的原理，用比色法测定NTPase活性。结果表明：本实验所建立的方法重复性好(批内差异3．8％叶．72％之间，批间差异系数为4．7％，均小于5％；酶活性为 10 u mol／L－250 u mol／L时线性关系最好，最低检出限为 5 u mol／L人 说明该方法具有稳定、灵敏、可靠、简便易行等优点，适于一般实验室应用。 2．主动脉内皮剥脱模型的建立：大鼠主动脉切片经HE染色显示，正常对照组大鼠主动脉壁各层结构完整， 2 中文摘要 内膜光滑，中膜VSMC排列整齐。主动脉内皮剥脱后3 大时，与正常血管壁相比，内膜显得粗糙，局部可见增生： 内皮剥脱后7天时，内膜出现显著的不规则增生，新生内 膜中可见局灶性细胞增殖，中膜VSMC核排列紊乱，在 新生内膜弹性膜附近处，VSMC走行改变，凸向管腔；术 后14上 大，内膜呈进行性弥漫性增厚，管腔变小，增厚 的内膜以细胞成分为主。上述形态学变化提示本研究所建 立的内皮剥脱后血管再狭窄动物模型是成功的。 3．主动脉内皮剥脱术后血管壁核膜NTPase活性的动 态变化：大鼠主动脉内皮剥脱后3大，NTPase活性较对 照组略有升高，但不明显(P＞0刀5人 至7天时，NTPase 活性显著升高(尸＜0刀5人 约为对照组的2倍。主动脉内 皮剥脱后14无至ZI大，该酶的活性持续升高，至ZI大 时，其活性是对照组的3倍左右。NTPase活性变化与血 管新生内膜厚度呈正相关(r＝o．918，P＜0刀5人 4．主动脉内皮剥脱术后VSMC表型标志蛋白的表达 变化：Western印迹分析表明，正常血管中分化型VSMC 标志蛋白 SM a仑ctin高表达，剥脱后 3天，SM。刁ctin 表达开始下降；7大时，SM Q《ctin的水平较对照降低了 24％；至 ZI 天时，SM Q－actin下降了 3 8％。SM Q－actin 的变化趋势与血管壁病变程度成反相关。OPN是去分化 型VSMC的标志蛋白，在正常大鼠主动脉OPN含量极微， 内皮剥脱后3天，动脉壁OPN水 迅速升高，达对照组 的13．3倍；至14大时，＊PN表达釉。达到高峰，是对照 组的3O二倍：内皮剥脱后刀天时，0＊N略有降低，但仍 维持在较高水平。OPN表达的时程变化与血管内膜增厚 3 中文摘要具有明显的正相关性。上述结果提示，内皮损伤诱发了中膜VSMC表型转化。部分VSMC由分化型转变为