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脊索瘤是起源于胚胎残余脊索组织的原发性恶性骨肿瘤,主要发生在中轴骨。近年来通过LOH、MI分析技术及癌基因、抑癌基因在染色体的定位初步发现脊索瘤的染色体变易主要在1p36及7q33。随着基因芯片微阵列分析、文库技术、生物信息技术、DDPCR、RFLP等新技术的发展与应用,在癌基因的扩增、抑癌基因的突变以及微卫星不稳定性分析等方面,对脊索瘤的发生、进展机制有了初步的揭示。但目前的实验研究多采用肿瘤旁正常组织作为对照,与脊索瘤不具有组织同源性,并且筛选通量较小,难以真实、全面反映脊索瘤发病相关基因的情况。本研究采用新鲜脊索瘤3例作为实验组,新鲜胎儿椎间盘髓核组织1例作为对照组,分别提取总RNA,纯化后进行反转录合成双链cDNA,纯化后进一步合成生物素标记的cDNA,并实现片段化。用试验组和对照组的生物素标记的cDNA分别与芯片杂交,ScanArray3000扫描与ImaGene软件分析结果并进行DNA测序,即得到脊索瘤与胎儿髓核组织的差异表达基因,设计差异表达基因的引物并进行免疫荧光定量PCR验证,对得到的差异表达基因进行生物信息学分析并揭示脊索瘤发病的相关机制。目的:1、使用胎儿髓核组织(在发育生物学上同源)作为正常对照进行脊索瘤发病机制的研究。2、在基因组水平上研究脊索瘤发病相关基因群进行筛选。3、完成对脊索瘤发病机制的初步探索,为脊索瘤的基因诊断、基因治疗提供靶基因。4、为进一步进行脊索瘤发病相关基因的基因敲除与转染研究奠定前期基础。方法:1、脊索瘤组织与胎儿髓核组织的收集:实验用十例脊索瘤组织标本均为2003年12月至2005年8月期间第二军医大学长海医院骨科手术切除标本。术中切除立即置入液氮罐中冻存备用。所有组织样本均经长海医院病理科免疫病理确诊为脊索瘤。胎儿髓核组织为2005年3月至8月期间第二军医大学长海医院妇产科引产胎儿髓核组织,引产后立即切取标本并置入液氮罐中冻存备用。2、脊索瘤组织与胎儿髓核组织RNA抽提及生物素标记的cDNA合成:将脊索瘤标本与胎儿椎间盘髓核组织标本,分别提取总RNA。总RNA的抽提采用QIAGEN’s总RNA抽提试剂盒进行(具体见RNeasy Total RNA Isolation kit说明手册)。抽提总RNA的质量及纯度采用Agilent 2100生物分析仪测定。双链cDNA的合成、生物素标记cDNA的合成以及cDNA的片段化等过程严格遵循Affymetrix? GeneChip? U133A芯片表达分析实验方法。3、基因芯片杂交:将前诉制备好的生物素标记的cDNA15μg分别与四张Affymetrix? GeneChip? U133A表达谱芯片杂交过夜。芯片杂交后的洗涤、染色过程遵照标准的Affymetrix? GeneChip? U133A表达谱芯片实验指南,通过全自动芯片洗涤工作站予以完成。芯片结果采用Affymetrix扫描仪3000进行扫描,Microarray Suite5.0软件读取、处理数据。4、数据分析:芯片杂交差异表达基因的筛选通过Microarray Suite5.0软件完成。ImaGene软件分析并选取芯片表达谱与SSH结果一致的片断,各脊索瘤组织与正常胎儿髓核组织差异表达≥2倍以上的基因(≥2或≦-2)被筛选出来,对差异表达基因的分析借助于GenBank数据库、swissprot数据库等综合完成,进行DNA测序,即得到脊索瘤与髓核组织的差异表达基因.对得到的差异表达基因进行生物信息学分析并揭示脊索瘤发病的相关机制。5、实时免疫荧光定量PCR验证:引物的设计:登录GENEBANK网站,以10个随机差异表达基因为模版设计上、下游引物。嵌合荧光法(SYBR? Green I)PCR:采用ABI SYBR? Green荧光定量PCR方法(具体反应体系见ABI SYBR? Green荧光定量PCR方法说明)。结果:1、脊索瘤标本与胎儿髓核标本之差异表达情况:以表达差异≥2倍为限,在Affymetrix? HG-U133A芯片包含的约14500个已知基因(约22000个转录本)中,三例脊索瘤样本与胎儿髓核标本分别的差异表达情况如下:样本1:上调968个基因,下调888个基因;样本2 :上调878个基因,下调896个基因;样本3:上调1150个基因,下调803个基因。三者与胎儿髓核组织相比较共同上调47个基因(见表8);共同下调153个基因(见表9)。200个共同差异表达的基因聚类分析情况见图10。在47个共同上调基因中,我们选取了TPD52、XAGE1、MAGE-1、MMP-7、MMP-9在组织标本中对其表达进行定量PCR验证。在153个共同下调基因中,我们选择了P16INK4a、FHIT、RNF-11、CASP9、c-myc等五个基因在瘤组织标本中对其表达进行定量PCR验证。2、10个差异表达基因的实时定量PCR验证结果:采用实时定量PCR的方法验证了上述10个基因在9例临床切除的脊索瘤标本中的表达情况。结果表明:在mRNA水平上,与胎儿髓核相比,全部脊索瘤组织标本显示与Affymetrix芯片同样的差异表达情况(见表13)。这进一步验证了芯片结果的可靠性。结论:1、脊索瘤的发病与包括癌基因、抑癌基因、肿瘤相关基因在内的多种基因高度相关。一些在其他组织来源的恶性肿瘤中业已被证明的与肿瘤发病相关的基因如TPD52、XAGE1、MAGE-1、MMP-7、MMP-9、P16INK4a、FHIT、RNF-11、CASP9、c-myc等都与脊索瘤的发病密切相关。研究各差异表达基因的功能有助于揭开脊索瘤发病之谜。2、基因组芯片技术可以在人类全基因组水平上大规模筛选肿瘤相关基因,是研究肿瘤发病机制的有力工具。