目的探讨重型/极重型再生障碍性贫血(SAA/VSAA)患者免疫抑制治疗(IST)前应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗的中性粒细胞反应(ANC反应),对于IST早期疗效的预测价值。方法回顾性分析我中心呢2005年9月至2011年11月间接受一线IST治疗,并于IST前接受G-CSF治疗的共125例SAA/VSAA患者临床资料。G-CSF治疗第n天内最大△ANC≥0.5×109/L定义为G-CSF治疗有ANC反应,<0.5×109/L定义为无反应。首先分别总结IST前应用G-CSF治疗有ANC反应组和无ANC反应组的IST近期疗效,并对二者进行相关性分析。进而为细化、优化这一预测指标,分别分析G-CSF治疗第5天、7天、10天、13天、14天、16天和21天有无ANC反应与IST早期疗效的关系,寻找预测IST早期疗效的最佳ANC反应时间。进而,绘制G-CSF治疗后10天内ANC增高程度(△ANC)预测IST疗效的ROC曲线,探索G-CSF治疗的ANC反应预测IST早期疗效的最佳△ANC界限值。结果IST前接受G-CSF治疗,获得ANC反应组IST后3个月血液学反应(HR)为49%,6个月HR为61.2%,均显著高于无ANC反应组(3个月HR 28.9%,P=0.023;6个月HR40.8%,P=0.026)。G-CSF治疗5天,7天内ANC反应尚不能提示IST后3个月及6个月HR,而以G-CSF治疗10 d内△ANC≥0.5×109/L作为ANC反应界值预测IST后3个月及6个月疗效最佳,ROC曲线下面积最大,且与更长时间应用G-CSF治疗ANC反应来预测IST后HR的效能接近。G-CSF治疗10 d内获得ANC反应为IST后3个月疗效的独立预后因素(P=0.004),但并非IST后6个月疗效的独立预后因素。G-CSF治疗ANC反应组患者5年总生存率显著高于无反应组[(92.8±4.0)%对(69.5±6.5)%,P=0.025]。结论IST前G-CSF治疗的ANC反应可提示骨髓残存造血,是方便、实用的预测IST早期疗效及长期生存的指标。目的分析不同中性粒细胞计数(ANC)阈值的极重型再生障碍性贫血(VSAA)患者接受一线免疫抑制治疗(IST)的早期血液学反应(HR)和长期生存情况。方法回顾性分析我中心2006年1月至2011年10月期间连续收治的145例接受一线r-ATG联合环孢素IST的VSAA患者临床资料。评估不同ANC阈值下VSAA患者的早期死亡、早期HR、长期生存情况,并以受试者操作特征曲线(ROC曲线)法优化ANC预测VSAA患者HR的临界值。并进行VSAA患者HR及生存相关因素分析。结果VSAA患者IST后3个月HR率为35.9%,6个月HR率为46.9%,5年OS率为75.0±3.7%,均明显劣于SAA(IST后3个月HR率为65.5%,P=0.000;6个月HR 率为 74.5%,P=0.000;5 年 OS 率为 92.5±2.6%,P=0.000)。且 VSAA 早期死亡率高达8.3%(SAA患者仅为2.7%,P=0.062)。设定VSAAIST前ANC阈值分别≤0.15×109/L、≤0.10×109/L和≤0.05×109/L,相应群组患者早期死亡率分别为9.2%(12/130)、9.9%(11/111)和 13.4%(11/82),即 12 例早期死亡的 VSAA 中有 11 例(91.7%)IST 前 ANC≤0.05 X 109/L;IST 后 3 个月 HR 率分别为 33.8%(44/130)、27.9%(31/111)和 22.0%(18/82);6 个月 HR 率分别为 43.8%(57/130)、39.6%(44/111)和 34.1%(28/82);5 年 OS 率分别为 73.1 ±4.0%、70.3±4.4%和62.5±5.4%;5 年 EFS 率分别为 48.3±4.5%、45.1 ±4.8%和 42.3±5.5%。以 0.05×109/L为ANC界值预测VSAA患者IST后6个月HR和12个月CR+GPR最佳,预测IST后6个月HR灵敏度为58.8%、特异度为70.1%;预测12个月良好HR灵敏度60.9%、特异度72.4%。ANC≤0.05×109/L的VSAA患者早期死亡率为11/82(13.4%),占VSAA 早期死亡患者的 91.7%(11/12);IST 后 3 个月 HR 率为 18/82(22.0%);6个月 HR 率为 28/82(34.1%);5 年 OS 率为(62.5±5.4)%;5 年 EFS 率为(42.3±5.5)%。结论ANC≤0.05×109/L的VSAA患者接受一线IST早期死亡率高、疗效差。目的ASXL1基因突变常见于各髓系肿瘤和骨髓衰竭性疾病的恶性转化,且为发生白血病转化和不良预后的相关因素。本研究旨在探讨ASXL1基因突变对人白血病细胞功能的影响及其作用的分子生物学机制,为ASXL1基因突变在髓系肿瘤性疾病中的作用提供更多依据,为个体化和靶向治疗提供更多的线索。方法应用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建ASXL1敲除的U937人白血病细胞系。应用流式细胞术进行GFP阳性单个细胞分选并扩增为单个细胞来源的克隆。Sanger测序检测各细胞系ASXL1基因突变情况,筛选出含ASXL1杂合及纯和突变的克隆细胞系。应用瑞士吉姆萨染色分析细胞形态,G带进行细胞染色体核型分析,应用5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡,研究其对各细胞系增殖抑制和凋亡诱导情况,应用PMA诱导细胞分化并比较ASXL1突变细胞系与野生型分化情况异同,应用流式细胞术测定细胞周期、细胞凋亡和细胞分化等。进行RNA测序筛选在ASXL1突变克隆中差异性表达的基因,并进而进行信号通路分析、基因集分析等,研究ASXL1突变对下游基因表达的影响,应用逆转录定量PCR和蛋白印迹法验证差异性表达基因。结果应用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合单个细胞分选技术构建单个细胞来源的人U937细胞系,共获得56个野生型细胞系(ASXL1基因野生型的U937单个细胞来源细胞系),另外17个突变型细胞系(6个含ASXL1杂合突变和11个含ASXL1纯和突变),突变细胞系均含有共同的c.594insA(Ser199Glufsx55)位点突变,此突变基因能够编辑提前终止编码的截短蛋白。其中3个ASXL1杂合突变克隆(MT1,MT2和MT3),3个ASXL1纯和突变克隆(MT11,MT12和MT13),2个转染后的ASXL1野生型克隆(WT1和WT2),以及未经转染的亲代细胞系WTblk用于进一步细胞功能及RNA测序等实验。整体来看,各个单细胞克隆之间异质性较大,但野生组与ASXL1杂合突变组、ASXL1纯和突变组,在细胞增殖,凋亡,细胞周期分布,5-氟尿嘧啶诱导的细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡方面并无显著差异。而ASXL1杂合突变组和ASXL1纯和突变组相对于野生组均表现出对于PMA诱导的单核细胞向吞噬细胞分化能力显著降低,表现为PMA诱导分化后96小时,CD11阳性细胞比例及CD11中位荧光指数均显著低于野生组。RNA测序及信号通路和基因集分析显示,ASAL1杂合及纯和突变克隆,髓系分化相关基因通路整体表达下降,其中与髓系分化相关的基因CYBB和CLEC5A表达水平显著降低。同时,与细胞存活相关的基因集包括干扰素a反应通路、MYC靶基因通路和STAT3靶基因通路等广泛下调。此外,染色体核型分析显示相对于未经转染的亲代细胞系WTblk,转染后的ASXL1野生型克隆并未出现额外的染色体核型异常,而ASXL1突变克隆不同程度得获得额外染色体异常,在4个检测的ASXL1突变克隆中有3个获得11号染色体长臂缺失。结论ASXL1基因突变通过下调与髓系分化密切相关的CYBB和CLEC5A等基因干扰髓系分化。此外,ASXL1突变广泛干扰与细胞生存相关的基因通路,并增加人白血病细胞的遗传不稳定性。我们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的ASXL1突变型人U937白血病细胞系可作为研究ASXL1作用分子机制的模型,并未未来研究ASXL1相关的髓系恶性肿瘤相关分子机制的研究提供可能。