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脊髓损伤导致运动感觉等神经功能严重损害,显著降低患者的生活质量,同时给家庭及社会造成严重的负担,对于个人、家庭及社会来讲是巨大的灾难。脊髓损伤后自发恢复能力差,目前针对脊髓损伤的治疗仍缺乏有效措施。干细胞移植为脊髓损伤的治疗带来了新的希望,成为近年来脊髓损伤研究的热点,并且展示出一定的治疗效果,同时前期的研究也发现移植的干细胞在移植部位存活时间较短,使干细胞不能持续发挥生物学作用的,在一定程度上限制了干细胞治疗的效果。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)取自胎儿附属物脐带。脐带来源充足,对捐献者无明显损害,易于获取;hUC-MSC易于分离、培养,增殖能力强、扩增迅速。这些特点使它在组织工程应用中具有巨大潜能,成为了近年来研究的热点。但移植到损伤部位的hUC-MSC在较短时间内迅速减少,限制了干细胞治疗效力,这可能是损伤后出血及继发炎症、缺血缺氧形成的病理环境导致了hUC-MSC凋亡。如何提升hUC-MSC移植治疗的生物学作用?或许可以通过提高hUC-MSC存活比例和时间来实现。姜黄素(Curcumin,cur)是从姜科植物根茎中提取的二酮类化合物。大量的研究显示其具有强大的抗氧化、抗炎的作用。前期我们课题组发现姜黄素能够抑制脊髓损伤后炎症因子的表达和反应性神经胶质增生,促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的改善。同时最近的研究还发现姜黄素可以抑制大鼠肾脏和心肌细胞凋亡,表明姜黄素还具有较可靠的抗凋亡作用。姜黄素是否同样可以抑制hUC-MSC凋亡,增加其存活的时间和比例,使其发挥更持久的生物学作用,进而提升hUC-MSC移植治疗效果有待进一步研究。基于以上理论,我们推测姜黄素可以抑制hUC-MSC凋亡的发生,本实验通过TNF-α诱导hUC-MSC凋亡并施以姜黄素干预,探讨姜黄素对hUC-MSC凋亡的作用及可能的机制,为姜黄素结合hUC-MSC移植治疗脊髓损伤等疾病提供初步的实验室依据。一、姜黄素在hUC-MSC凋亡中的作用目的:探讨姜黄素(curcumin,cur)对TNF-α诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)凋亡的影响。方法:体外培养hUC-MSC,给予5 ng/mL TNF-α诱导细胞凋亡,给与不同浓度cur干预,使用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞凋亡情况;选取4μmol/L的姜黄素作为干预剂量,采用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,进一步验证cur对TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡的作用。Western blot检测肿瘤坏死因子-α受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)下游凋亡相关的MAPK家族信号通路(ERK,JNK,P38)激活情况。结果:1.LDH释放实验提示:当TNF-α浓度高于5 ng/mL时导致hUC-MSC凋亡。2.Cur浓度在0.5~4μmol/L时可以抑制TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡,且呈浓度度赖性。流式细胞仪检测也证实4μmol/L cur能显著抑制TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡(P<0.05)。3.Western blot检测发现:Cur可以激活ERK,但不影响MAPK家族JNK、P38蛋白表达。结论1.姜黄素能抑制TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡。2.姜黄对TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡的抑制作用可能与激活ERK有关。二、姜黄素抑制hUC-MSC凋亡的机制研究目的:进一步探讨姜黄素(curcumin,cur)抑制TNF-α诱导hUC-MSC凋亡的机制。方法:体外培养hUC-MSC,继续使用TNF-α诱导细胞凋亡,并予以姜黄素干预。使用U0126阻断ERK的激活。Western blot检测ERK的阻断情况,及下游促细胞存活相关蛋白Bcl2表达情况以及Bad磷酸化情况。在ERK阻断有效阻断条件下,使用流式细胞技术对比ERK阻断前后姜黄素对TNF-α诱导人脐带间充质干细胞凋亡的影响。结果1.U0126可以有效的阻断姜黄素和TNF-α对ERK通路的激活。2.促细胞存活相关蛋白Bcl2表达情况以及Bad磷酸化在ERK被激活后增加,当ERK被阻断后降低。3.流式细胞技术检测发现ERK被阻断后,姜黄素对TNF-α诱导的hUC-MSC凋亡不再有抑制作用。结论:姜黄素通过激活ERK,促进促细胞存活相关蛋白Bad磷酸化以及Bcl2表达,进而发挥抑制TNF-α诱导hUC-MSC凋亡的作用。