研究目的:近年来,蛋白类食品添加剂如卵黄抗体和溶菌酶等被广泛添加于食品、药品当中,对于此类物质的常见检测方法主要包括免疫印迹（Western Bolt,WB）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等,但存在检测成本高、检测时间长等问题,且由于大多数食品样品中的成分较为复杂,使得这些方法在实际应用时多存在稳定性差和灵敏度欠佳等不足。因此建立快速、准确、特异的蛋白现场检测技术对生产经营企业、质控人员和政府管理部门尤为关键。本论文旨在构建一种快速、特异可视化检测蛋白类物质的方法,同时对该方法进行评价,研究成果可为食品药品等领域对蛋白类物质的检测提供一定的技术支持。研究方法:本论文建立了一种可视化检测卵黄抗体和溶菌酶的方法。1.基于分子印迹技术可视化检测卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）,即以羧基化的四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄-COOH）为内核,含有邻苯二酚和胺官能团的多巴胺（Dopamine,DA）为功能单体和交联剂,在弱碱性的条件下发生自聚合作用,在Fe₃O₄纳米粒子表面形成具有邻苯二酚和醌活性基团的聚多巴胺（Polydopamine,PDA）涂层^[1,2],表面偶联IgY形成分子印迹聚合物。利用十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）对聚合物进行洗涤去除模板分子,外加磁场进行分离,制备的磁性分子印迹聚合物（Magnetic molecularly imprinted polymer,MMIPs）表面带有与IgY结构互补的特异性“孔穴”。同时结合Fe₃O₄纳米粒子过氧化物模拟酶的作用,即在H₂O₂存在时,能够催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）生成蓝色的氧化TMB（oxTMB）,最大吸收峰在652 nm处。当待检样品中含有目标蛋白时,MMIPs与其特异性结合,特异性位点减少,催化活性降低,依据目标物的含量和蓝色深浅的比例关系,实现快速、特异、可视化检测IgY的目的。2.基于分子印迹技术可视化检测溶菌酶（Lysozyme,Lyz）。该方法以羧基化的四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄-COOH）作为内核,以Lyz为模板蛋白,以DA作为功能单体和交联剂。在弱碱性的条件下,带负电荷的Fe₃O₄纳米粒子吸附带正电荷的Lyz。同时DA的自聚合作用可在Fe₃O₄纳米粒子的表面形成具有大量非共价基团的PDA薄膜,Lyz以Fe₃O₄@PDA为载体嵌入到PDA层中,利用5%冰醋酸-SDS将嵌入的Lyz洗脱,获得表面具有与Lyz相互补的特异性识别位点的印迹聚合物微球。外加磁场进行分离,在含有Lyz的实际样品中对其进行特异、快速、高效富集分离。同时结合磁性纳米酶催化比色技术,依据目标蛋白的含量与蓝色产物的反比例关系,并对肉眼观察结果和UV-Vis检测结果进行分析,实现对待检样品中Lyz的快速可视化检测。研究结果:1.基于分子印迹技术可视化检测IgY。从Fe₃O₄纳米粒子和聚合物的的表征结果中可以看到,本课题中合成的Fe₃O₄纳米粒子是分散性良好且尺寸较为均一的类球形结构,平均粒径为190±20 nm。MMIPs和磁性分子非印迹聚合物（Magnetic molecular non-imprinted polymers,MNIPs）的表面由于DA的自聚合作用在Fe₃O₄纳米粒子表面多出一层PDA薄膜。MNIPs与MMIPs相比,其表面的PDA层更为光滑。在最佳检测条件下,IgY浓度在0.002⁰.2 mg·mL^-1范围内具有良好的线性趋势,线性回归方程为y=-3.0504x+0.9311（R²=0.9852）,仪器检测限为0.013 mg·mL^-1,可视化检测限为0.02 mg·mL^-1。奶粉基质中的加标回收率在86.7%¹02.6%之间,相对标准偏差在2.4%⁵.1%（n=3）之间。研究结果表明该方法特异性良好,操作简单,整个检测过程在2.5 h内完成,裸眼即可判读结果。2.基于分子印迹技术可视化检测Lyz。表征结果显示,成功制备出磁性分子印迹聚合物。当DA与Fe₃O₄纳米粒子的含量比值为3:5,富集时间为30 min时,印迹聚合物薄膜对Lyz的富集效果最佳,吸附容量可达138.77 mg·g^-1。最佳实验条件下,该方法在Lyz浓度为0.008⁰.08 mg·mL^-1范围内具有较好的线性关系,线性回归方程为y=-5.0537x+0.9034（R²=0.9356）。该方法仪器检测限为0.025mg·mL^-1,可视化检测限为0.02 mg·mL^-1,实际样品溶菌酶肠溶片检测加标回收率在96.82%¹03.03%之间,相对标准偏差在2.24%⁷.57%（n=3）之间,整个检测过程可在1 h内完成。研究结论:1.基于磁分离技术对待检样品卵黄抗体和溶菌酶进行分离,无需离心或过滤,简化了实验步骤,达到了较好的分离效果。2.基于分子印迹技术检测卵黄抗体和溶菌酶,即通过在磁纳米粒子表面修饰PDA层,并利用模板分子进行压印产生特异性“孔穴”,提高了印迹聚合物对目标蛋白的选择性。3.本课题建立了一种检测卵黄抗体和溶菌酶的比色新方法,即基于分子印迹技术、纳米酶比色分析法及磁分离技术,依据实际样品中目标蛋白的含量和蓝色氧化TMB产物之间的反比例关系实现对其快速可视化的检测。该方法具有特异性好、准确度高、操作简单和价格低廉等优点。