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近年来,具有多种特有溶剂性质的离子液体作为一种新型非水生物催化溶剂引起了人们多方面的关注。实验证明许多酶能在离子液体组成的两相体系或单相体系中保持催化活性。如目前研究最多的脂肪酶和蛋白酶在离子液体中的活性、稳定性和反应选择性均有较好的表现,含离子液体介质中的生物催化反应具有广阔的应用前景。当前,相关研究主要集中在讨论含离子液体介质中生物催化某一反应的可能性,且涉及到的反应类型和生物催化剂的种类非常有限。通过对比研究离子液体中的酶促反应以揭示离子液体中酶催化特性的研究报道甚少,结合离子液体中酶分子构象的研究探讨离子液体中酶催化特性的研究更为鲜见。
辣根过氧化物酶能利用过氧化氢或氢过氧化物氧化一系列有机和无机物,如苯酚、苯胺、联苯胺及其取代物,其在不对称催化方面的应用也日益受到重视。关于过氧化物酶在离子液体中的研究也很少,因而研究离子液体的溶剂性质对辣根过氧化物酶催化特性的影响规律,对过氧化物酶在非水相中催化反应机理的研究以及对离子液体的分子设计和合成均具有重要的意义。
基于以上情况,本文通过辣根过氧化物酶利用过氧化氢催化愈创木酚氧化的显色反应,研究了辣根过氧化物酶在七种亲水性离子液体[C_2mim][BF_4]、[C_4mim][BF_4]、[C_6mim][BF_4]、[C_4mim]HSO_4 、[C_4mim]C_l、[C_4mim]NO_3 、[C_4mim][CF_3CO_2]和磷酸缓冲盐溶液组成的混合溶剂中的活性变化规律,探讨离子液体的组成及溶剂性质与辣根过氧化酶的催化活性、热稳定性之间的关系。结果表明辣根过氧化物酶在不同种类的离子液体中均有不同程度的失活,辣根过氧化物酶活性随离子液体极性增强而降低,而稳定性随着疏水性的增强而降低。在含[C_4mim]Cl离子液体的介质中,该反应在最佳条件下的表观动力学参数分别为V_0=2.49mmol·L~(-1)·min~(-1)、V_(max)=3.49mmol·L~(-1)·min~(-1)、0.28 mmol·L~(-1)。研究了辣根过氧化物酶在[C_4mim]Cl中的热失活动力学,可以用简单的一级失活模型来表示辣根过氧化酶在[C_4mim]Cl中的失活反应:E_t/E_0=exp(-K_dt)。辣根过氧化物酶在20℃时开始失活,随着温度升高,[C_4mim]Cl对辣根过氧化物酶的失活过程起加速作用,当温度在60℃的时候,辣根过氧化物酶在40％(v/v)的[C_4mim]Cl中的半衰期为12min,温度低于40℃时的半衰期大于1000min。
同样,离子液体的组成及溶剂性质对辣根过氧化物酶催化苯甲基硫醚不对称氧化的反应也有重要的影响。向反应体系中添加低于15％的的离子液体时能够提高辣根过氧化物酶催化苯甲基硫醚不对称反应的速度和产物的对映选择性,但当离子液体的添加量大于20％时候,辣根过氧化物酶的催化活性下降的较快。在七种亲水性离子液体[C2mim]BF4]、[C4mim][BF4]、[C6mim][BF4]、[C4mim]HSO4、[C4mim]Cl、[C4mim]NO3、[C4mim][CF3CO2]和磷酸缓冲盐溶液组成的混合溶剂中辣根过氧化物酶的催化也活性随着离子液体的极性增大而降低。但在含[BF4]-的介质中,由于[BF4]-释放出来的F-会结合到辣根过氧化物酶的血红素中心从而降低了酶的催化活性。筛选出适合辣根过氧化物酶催化硫醚为亚砜的一种离子液体[C4mim]Cl进行进一步的研究,在离子液体浓度、过氧化氢添加方式、反应温度、pH值、底物浓度、震荡速度分别为15％(v/v)、1次添加过氧化氢、25℃、6.5-7.0、0.5mmo/L的条件下反应8h,反应初速度为1.9μmol/L·min,得率为75％,产物的对映选择性为53％；当过氧化氢分5次添加的时候,得率为92％,产物的对映选择性为69％。最后用紫外-可见光光谱法分析了含不同离子液体介质中木瓜蛋白酶分子构象的变化。紫外-可见光谱研究表明,在含[C2mim][BF4]、[C4mim][BF4]、[C6mim][BF4]、[C4mim]HSO4、[C4mim]Cl、[C4mim]NO3的介质中,辣根过氧化物酶血红素中心最大吸收峰没有发生变化,但吸收值增强,证明血红素基团暴露在介质中而增强了吸收；而在含[C4mim][CF3CO2]的介质中,辣根过氧化物酶血红素中心最大吸收峰区发生蓝移,证明有部分血红素基团被离子液体破坏而脱落。