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烟草曲叶病毒病是热带和亚热带产烟区的主要病害之一,我国云南、广西、广东和福建省等烟区发病较为普遍,是导致烟叶产量和质量下降的原因之一。为了明确广西百色市的烟草曲叶病毒病的病原种类和组成,我们从广西百色市靖西县、乐业县、德保县和凌云县等烟区采集具有典型曲叶病症状的烟草样品并进行分子检测与鉴定。
用双生病毒简并引物PA/PB,以选取的9个表现典型曲叶症状的样品叶组织的总DNA为模板,进行PCR检测,均可扩增出约500bp的特异性片段。用简并引物bego1/bego6和bego2/bego3对9个样品进行PCR的扩增,测序拼接后获得10个分离物的全基因组序列。10个分离物之间的相似性为80.3％～99.5％不等,其中JX-2分离物与其他9个分离物的同源性均低于82.0％,其他9个分离物相似性在93.3％～99.5％之间。序列分析结果表明,这10个分离物分别属于2种病毒:中国番茄曲叶病毒(TamatoleafcurlChinavirus,ToLCCNV)和中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowlefcurlChinavirus,TYLCCNV)。
JX-2为来自靖西新靖镇的分离物,全序列测定结果表明,JX-2DNA-A全长为2738个核苷酸(nts),编码6个开放阅读框。基因组序列比对分析发现,JX-2DNA-A与ToLCCNV的各分离物的相似性较高(均大于95.0％),其中与ToLCCNVG32分离物的相似性最高,达99.2％,表明JX-2是ToLCCNV的一个分离物。利用DNAβ的特异引物在JX-2样品扩增到DNAp(JX-2β),全长1341nts,与ToLCCNV分离物伴随的DNAβ相似性最高,达到96.1％。这是首次从烟草上分离到的ToLCCNV及其伴随DNAβ。
对JX-1、JX-3-1、JX-3-4、JX-4、JX-5、JX-6、DB-1、LY-1和LeY-1进行克隆测序分析,发现这9个分离物DNA-A全长2728-2734nts,各分离物之间的相似性在93.3％-99.5％之间,与TYLCCNV各分离物的相似性最高,表明9个分离物均为TYLCCNV。其中JX-1,JX-3-1、JX-4,JX-6和DB-1与TYLCCNV-[G102]分离物相似性最高(95.0％以上),而LeY-1和LY-1与TYLCCNV-[CHI]分离物相似性最高(分别为96.6％和96.9％)。对X-3-4和JX-5序列比较分析发现,这两个分离物是经云南辣椒曲叶病毒(PepperleafcurlYunnanvirus,PepLCYNV)和TYLCCNV的重组而产生的。用引物bego1/beg06扩增JX-3、JX-5样品,获得PepLCYNV的部分DNA-A片段,推测除了TYLCCNV,JX-3和JX-5样品同时存在PepLCYNV。DNAβ的PCR检测结果表明,8个样品中均存在DNAβ,测序结果显示所有DNAβ之间具有较高的相似性(94.0％-99.0％),其中JX-3与ToLCCNV-[G14]所携带的DNAβ具有最高的相似性为92.0％,TX-6与TYLCCNV-[G102]所携带的DNAβ相似性为98.0％。此外,在JX-3、JX-5和JX-6样品中检测到病毒的DNA1,3个DNA1分子的相似性在88.9-95.3％之间,均与TYLCCNV所携带的DNA1具有较高相似性。
本论文同时构建了JX-2、JX-3和JX-6的DNA-A及DNAβ的侵染性克隆,为进一步研究这些病毒的致病性奠定了基础。