一、研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种可发生于任何年龄的慢性自身免疫性疾病,主要临床表现为侵蚀性关节炎,基本病理表现为滑膜炎症、血管翳形成,关节软骨的侵蚀、骨的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失。其发病机制目前尚不明确。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)在RA中数量病态性增加,凋亡减少,形成血管翳,侵蚀软骨,最终引起骨的破坏。在RA中,RA-FLS的激活是受多种信号通路影响,其中Wnt信号通路是近年来研究的热点,被认为在RA的发生发展中起到了非常重要的作用。锌指环指蛋白3(Zinc and ring finger 3,ZNRF3)是近年来发现的一种Wnt通路负反馈调控蛋白,其通过泛素化降解细胞膜表面Wnt蛋白受体卷曲蛋白(Frizzled,Fz),起到抑制Wnt信号通路活性的作用。但是目前关于ZNRF3的研究多集中于肿瘤,RA中还没有ZNRF3的相关研究。因此,本课题观察比较了ZNRF3在RA患者滑膜组织中的表达,以及ZNRF3对于RA-FLS的生物学行为的影响,同时进行体内实验,观察了ZNRF3对于CIA小鼠的影响,探讨了相关分子机制。二、研究目的第一部分:明确ZNRF3在RA患者滑膜组织及细胞中表达情况。第二部分:研究ZNRF3对成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭及炎症反应的作用。第三部分:研究ZNRF3对胶原诱导关节炎小鼠模型关节肿胀、滑膜炎症、滑膜细胞凋亡、软骨和骨的破坏、炎症因子的分泌的影响。第四部分:探讨ZNRF3在RA发生发展中的分子机制。三、研究方法第一部分:(1)收集RA、骨关节炎(Osteoarthritis,OA)、创伤(Trauma)患者滑膜,酶消法提取人原代成纤维样滑膜细胞。(2)HE染色比较三组滑膜组织病理。(3)免疫组化法比较ZNRF3在三组滑膜组织中的表达情况。(4)流式细胞仪、细胞免疫荧光鉴定细胞。(5)免疫荧光法观察ZNRF3在三组FLS中的表达。(6)通过实时定量PCR(qPCR)和免疫印迹法(Western Blot)比较ZNRF3在三组患者滑膜组织和FLS中的表达情况。第二部分:(1))构建慢病毒载体,进行慢病毒包装。(2)慢病毒感染RA-FLS细胞,使用嘌呤霉素筛选。(3)qPCR和Western Blot法检测转染效果。(4)CCK8法测细胞活性,比较感染后RA-FLS增殖情况。(5)流式细胞仪检测感染后RA-FLS细胞晚期凋亡率,Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。(6)流式细胞仪检测感染后RA-FLS的细胞周期。(7)划痕实验和Transwell迁移实验比较感染后RA-FLS的迁移能力。(8)Transwell侵袭实验比较感染后RA-FLS的侵袭能力。(9)提取RNA及蛋白,分别用qPCR及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-1β、IL-6、IL-8的表达水平。第三部分:(1)构建慢病毒载体,进行慢病毒包装。(2)建立CIA模型。(3)小鼠关节腔注射慢病毒,活体成像实验进行验证。(4)记录CIA模型小鼠足爪关节炎指数。(5)眼球摘除取血处死小鼠。(6)使用多因子试剂盒,通过流式细胞仪检测小鼠血清中炎症因子TNF-a、IL-1B、IL-6的表达水平。(7)取小鼠膝关节,固定、脱钙、切片后HE染色观察小鼠膝关节病理改变,并对进行评分。(8)使用番红O-固绿观察小鼠膝关节软骨破坏情况,并进行评分。(9)荧光TUNEL法检测膝关节滑膜细胞凋亡情况。第四部分:(1)Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路及NF-κB信号通路相关蛋白。(2)构建ZNRF3过表达质粒和siRNA干扰序列后用脂质体转染细胞,Western blot法鉴定转染效果。(3)质粒共转染后行双荧光素酶报告基因实验,验证ZNRF3对TCF/LEF-1以及NF-κB启动子的活性。四、结果第一部分:(1)成功分离培养出FLS,于第3代对细胞进行细胞鉴定,流式细胞仪显示培养出的细胞CD90和CD29双标的阳性率>90%,免疫荧光显示绝大多数细胞表现为Vimentin蛋白阳性以及CD68阴性。(2)滑膜HE结果显示与OA和Trauma患者相比,RA组滑膜增厚且有大量炎症细胞浸润。(3)滑膜组织的免疫组化、qPCR以及Western blot结果均显示RA患者滑膜中ZNRF3的表达明显高于Trauma患者,但是与OA组患者相比,差异无统计学意义。(4)免疫荧光显示ZNRF3在RA-FLS中定位于细胞质及质膜。(5)qPCR以及Western blot结果显示RA患者FLS中ZNRF3的表达明显高于Trauma患者,但是与OA组患者相比,差异无统计学意义。第二部分:(1)当干扰对照(Sh-ctr)感染复数(Multiplicity of infection,MOI)=10,ZNRF3干扰慢病毒(Sh-ZNRF3)MOI=30,过表达对照(LV-ctr)MOI=10,ZNRF3过表达慢病毒(LV-ZNRF3)MOI=40时,感染效率可满足实验要求。(2)与Sh-ctr组相比,Sh-ZNRF3明显抑制RA-FLS的增殖,给予TNF-α刺激后,Sh-ZNRF3组的细胞活性进一步下降;与LV-ctr相比,LV-ZNRF3可进一步促进RA-FLS的增殖,且这种促进增殖的效果在TNF-α刺激的情况下依旧存在。(3)流式细胞仪凋亡检测结果显示Sh-ZNRF3组的凋亡率明显高于Sh-ctr组,LV-ZNRF3组的细胞凋亡率明显低于LV-ctr组。(4)Western Blot结果显示,与空白对照组和Sh-ctr组相比,Sh-ZNRF3组Bcl2的表达量明显减少,Bax表达量明显增加,cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达量明显增加;与空白对照组和LV-ctr组相比,LV-ZNRF3组Bcl2的表达量明显增加,Bax表达量明显减少,cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达量明显减少。(5)抑制ZNRF3的表达可阻滞RA-FLS细胞G0/G1期,从而抑制其增殖,而增加ZNRF3的表达可以促进细胞从G0/G1期向S其进展,从而促进RA-FLS增殖。(6)与Sh-ctr组相比,Sh-ZNRF3组中RA-FLS的迁移率明显减少;但是LV-ZNRF3组中RA-FLS的迁移作用与LV-ctr组相比,差异没有统计学意义。(7)Transwell小室迁移实验结果显示Sh-ZNRF3组的迁移的细胞数明显少于Sh-ctr组的;LV-ZNRF3组的迁移的细胞数和LV-ctr组差异没有统计学意义。(8)Transwell小室侵袭实验结果提示Sh-ZNRF3组的侵袭的细胞数少于Sh-ctr组;LV-ZNRF3组的侵袭的细胞数与LV-ctr组相比差异没有统计学意义。(9)qPCR和ELISA结果均提示Sh-ZNRF3可以抑制RA-FLS分泌IL-1β、IL-6、IL-8,而LV-ZNRF3可以促进RA-FLS分泌IL-1β、IL-6、IL-8。第三部分:(1)Sh-ctr组和Sh-ZNRF3组的关节炎指数均较正常对照组小鼠的关节炎指数明显升高,但是从第35日开始Sh-ZNRF3组小鼠的关节炎指数较Sh-ctr组关节炎指数低;LV-ctr组和LV-ZNRF3组的小鼠关节炎指数随着时间推移逐渐升高,仅在第38日时,LV-ZNRF3关节炎指数高于LV-ctr组。(2)活体成像实验结果显示膝关节注射的病毒在小鼠膝关节内稳定表达。(3)膝关节HE染色结果显示Sh-ZNRF3组病理评分低于Sh-ctr组,而LV-ZNRF3组评分与LV-ctr组未见明显差异。(4)Sh-ZNRF3组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6均较Sh-ctr组明显减少,而LV-ZNRF3组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6均较LV-ctr组增加。(5)番红O-固绿实验显示Sh-ZNRF3组软骨侵蚀程度评分低于Sh-ctr组,而LV-ZNRF3组软骨侵蚀程度评分与LV-ctr组未见明显差异。(6)TUNEL法未观察到Sh-ZNRF3及LV-ZNRF3对滑膜细胞凋亡的影响。第四部分:(1)Western blot结果显示与Sh-ctr+TNF-α组相比,Sh-ZNRF3+TNF-α组中磷酸化的GSK3β表达量增加,但是β-catenin、C-myc表达量明显降低;而与LV-ctr+TNF-α组相比LV-ZNRF3+TNF-α组中磷酸化GSK3β降低,但是β-catenin、C-myc的表达升高。(2)使用双荧光素酶报告基因系统检测TCF/LEF-1报告基因活性结果显示Si-ctr+TNF-α组RLU1/RUL2比值明显高于Si-ZNRF3+TNF-α组;Ctr+TNF-α组RLU1/RUL2比值明显低于ZNRF3+TNF-α组。(3)Western blot结果显示与Sh-ctr+TNF-α组相比,Sh-ZNRF3+TNF-α组中磷酸化的p65、磷酸化的IκBα表达降低;而与LV-ctr+TNF-α组相比,LV-ZNRF3+TNF-α组中磷酸化的p65、磷酸化的IκBα表达升高。(4)使用双荧光素酶报告基因系统检测NF/κB报告基因活性结果显示Si-ctr+TNF-α组RLU1/RUL2比值明显高于Si-ZNRF3+TNF-α组;Ctr+TNF-α组RLU1/RUL2比值明显低于ZNRF3+TNF-α组。五、结论本课题通过临床组织标本研究、原代细胞体外实验研究、构建动物模型体内研究、作用机制的研究这四个部分的研究,发现了ZNRF3在RA患者滑膜组织和FLS中高表达,ZNRF3在体内体外都可促进RA-FLS的增殖和炎性因子的产生,加重RA的进展,进一步探究ZNRF3产生这种作用的机制,发现可能与其交叉调控Wnt/β-catenin信号通路和NF-κB信号通路相关,ZNRF3抑制GSK3β磷酸化的同时激活NF-κB信号通路,使IKK表达增多,抑制β-catenin的降解,促进了胞质内的β-catenin聚集,上调β-catenin/TCF的转录活性。这为RA的干预治疗提供了一个新的潜在靶点。