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MicroRNAs (miRNAs)是短(约22个核苷酸)非编码RNAs,其调节转录后基因沉默[1;2]。miRNAs通常通过不完全碱基配对在mRNAs 3’未翻译区(UTR)结合它们的靶mRNAs并通过抑制mRNA翻译或通过促进mRNA降解来影响蛋白表达,参与细胞分化、增殖、凋亡以及各个组织器官正常发育的过程。在哺乳动物中,发现了数百种不同miRNAs,包括那些选择性地表达在大脑中的miRNAs[3]。然而仅少量miRNA的靶基因已确认并且在体内证明功能上是重要的[7]。现有研究表明miRNAs在发育早期[4]和疾病例如癌症[5]以及神经变性[6]中起重要作用,在哺乳动物中,miR-132通过靶基因p250GAP调控树突棘发育[8; 9],miR-134和miR-138分别通过抑制LIMK1和APT1参与树状棘发育[10; 11]。脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是遗传性智力低下最常见的原因[12; 13]之一,公认的病理改变为不成熟的树突棘,这种不成熟树突棘导致突触可塑性异常被认为是FXS发病机制的核心[22; 23]。FXS是FMR1基因三核苷酸重复序列不稳定扩增导致脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)表达的转录沉默所致。既往研究已表明FMRP是一种RNA结合蛋白,可抑制某些与树突棘发育和突触可塑性相关的mRNA翻译和蛋白质合成。由于FMRP与miRNA同样具有翻译抑制活性,脆性X综合征因此也成为RNAi研究中最早与人类疾病相联系的疾病之一。FMRP在生物化学和遗传学上与miRNA通路联系。虽然FMRP与RNA干扰沉默复合体(RISC)中的蛋白(例如Argonaute和Dicer)以及miRNAs相互作用,但是FMRP本身对RNAi介导的mRNA降解并非必不可少[14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21]。FMRP与miRNA关系、以及miRNA在FXS发病机制中的作用尚待明确。本课题采用miRNA芯片技术比较正常小鼠及Fmr1敲除小鼠脑组织miRNA表达谱,并予Real-time PCR验证差异表达的miRNAs,进一步应用生物信息学软件预测这些miRNAs与树状棘发育和突触可塑性相关的靶基因,探讨这些miRNAs在FXS发病中的分子机制。本课题对FMRP-miRNA相互作用机制的研究,有望为阐明FXS的发病机制提供新的思路。材料与方法:取FVB品系1周龄雄性Fmr1基因敲除小鼠( Fmr1 knockout mouse KO, KO1W)海马组织用于研究,并采用同龄野生雄性小鼠(wild type mouse WT,WT1W)作对照。实验前取尾部提取DNA,PCR技术进行基因型鉴定。KO小鼠和WT小鼠各3只。腹腔注射1%戊巴比妥钠(sodium pentobarbital,0.1-0.2 ml)麻醉动物,快速断头取脑,在冰台上取出脑组织分离海马,海马组织用1ml RNALater保存。每只小鼠做一次miRNA芯片的技术重复,共计12张miRNA芯片。差异miRNA筛选标准:q-value(%)≤5,同时差异倍数即Fold Change控制在1.5倍以上,样本数≥3,Ratio=KO / WT。结果:1. Fmr1基因敲除小鼠和野生小鼠海马组织中miRNA的表达标本数n=3时(12张芯片聚类分析时)可获得表达上调的miRNA 8个(详见Excel 1),无表达下调的miRNA;标本数n=3时两个样品聚类异常,因此重新聚类。标本数n=2时(8张芯片聚类分析时)可获得表达上调的miRNA 56个(详见Excel 2),表达下调的miRNA 20个(详见Excel 2)。2. Real-time PCR验证差异表达的miRNAReal-time PCR验证Fmr1基因敲除小鼠差异表达的miRNA,结果发现miR-449a(P=0.014)表达上调。而芯片结果中下调的miR-714 (P=0.035)、miR-720(P=0.017)在Real-time PCR结果中表现为上调。3.差异表达的miRNA的靶基因预测预测上述3个经Real-time PCR验证的miRNA的靶基因,与神经元/树突棘发育相关的靶基因,结果为miR-714的靶基因:Ephb4/Ephb2、Ret、Cdkn1c;miR-720的靶基因:Ndel1、Fyn、Cdk5、Relb;miR-449a的靶基因:MAP1A、ARHGAP1。预测到与突触可塑性相关的靶基因:miR-714的靶基因:Dlgap2、Ephb4/Ephb2、Pxk、Cpne6、Snta1 ; miR-720靶基因: Snca、Efna1、Uba52/Ubc/Ubb/Rps27a、Musk、Pick1;miR-449a靶基因:SYT1。4. Real-time PCR验证miRNA靶基因对上述所预测的miRNA靶基因进行Real-time PCR验证发现:神经元/神经元树突棘发育相关的靶基因Cdk5(P=0.045 )在Fmr1基因敲除小鼠中表达下调;突触可塑性相关的靶基因Ubb(P=0.014 )、SYT1(P=0.003 )、Efna1(P=0.019 )在Fmr1基因敲除小鼠中表达下调。结论:通过miRNAs芯片在Fmr1基因敲除鼠脑组织中获得多种差异表达的miRNAs,提示miRNA异常表达可能参与了FXS的发病机理。通过生物信息学预测差异表达的miRNAs靶基因,并经Real-time PCR验证,在Fmr1基因敲除鼠脑组织中发现了与树突棘发育以及突触可塑性相关的靶基因,提示miRNAs可能通过调控树突棘发育和突触可塑性参与脆性X综合征的致病机理。