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次黄嘌呤(Hypoxanthine,I)是DNA中一种常见的损伤碱基,主要来源于腺嘌呤的脱氨基作用,具有致突变性。高温加剧了腺嘌呤脱氨基形成I的速率,暗示着极端嗜热古菌基因组DNA的稳定性受到严峻的挑战。核酸内切酶是驱动DNA中I修复的关键酶。但是,目前极端嗜热古菌DNA中I的修复机制尚不清楚。极端嗜热古菌 Termococcus barophilus 和Thermococcus gammatolerans均分离自深海热液口,其最适生长温度为85℃左右。这两种古菌基因组DNA的测序已经完成,均编码了核酸内切酶V(EndoV)和核酸内切酶NucS。本论文分别以Tba EndoV和Tga NucS这两种核酸内切酶为研究对象,研究了它们切割I-DNA的生化性质,并初步探讨了 Tga NucS的催化机理。本论文的第一部分内容主要开展了 Tba EndoV和Tga NucS基因克隆、诱导表达及纯化的研究。首先,利用PCR技术扩增了 Tba EndoV和Tga NucS的基因,进一步将其克隆至pET-30a(+)表达载体中。利用热激法将含有目的基因的表达载体转化至表达菌株的感受态细胞。通过加入诱导物IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)进行诱导表达目的蛋白,然后经过热处理、Ni柱亲和纯化等步骤纯化得到Tba EndoV和Tga NucS 蛋白。本论文的第二部分内容研究了 Tba EndoV切割I-DNA的生化性质。研究发现,Tba EndoV不能够切割正常DNA和U-DNA,而能够切割I-DNA。该酶切割I-ssDNA反应的最适温度为50～90℃。经过100℃处理90 min后,Tba EndoV切割I-ssDNA的效率仍为90%,表明该酶为极其热稳定性的核酸内切酶。此外,我们还发现Tba EndoV切割I-ssDNA反应的最适pH为7.5～9.0。该酶切割I-ssDNA时需要二价金属离子,具体表现为Ni2+、Mg2+和Mn2+存在时,Tba EndoV能够切割I-ssDNA,其切割效率为Mn2+>Mg2+>Ni2+。Tba EndoV能够耐受300 mM的NaCl浓度,但更高浓度的NaCl(>500 mM)会抑制该酶的酶活。进一步的研究发现,Tba EndoV在相同温度条件下切割I-ssDNA的能力要高于其切割I-dsDNA的能力。结合实验结果表明,Tba EndoV结合I-ssDNA的能力要强于其结合I-dsDNA的能力。因此,该酶倾向于识别和切割ssDNA中的I。本论文的第三部分内容关于Tga NucS切割I-DNA生化性质的研究。研究发现,Tga NucS能够在55℃切割I-ssDNA,而在80℃切割I-dsDNA。此外,Tga NucS切割I-dsDNA反应的最适温度为75～80℃,最适pH为pH 7.0～9.0。该酶切割I-dsDNA需要二价金属离子,其中Mn2+和Mg2+为其最适金属离子。另外,高盐会抑制Tga NucS切割I-dsDNA。进一步的研究发现,Tga NucS与限制性核酸内切酶类似,均能够对DNA两条链进行切割,其切割位置为次黄嘌呤的5’端第二个磷酸二酯键和互补链中对应模板碱基T的5’端第三个磷酸二酯键。因此,该酶的切割产物为5’端含有4个核苷酸长度突出末端的断裂双链DNA。对Tga NucS切割产物的再连接实验,我们发现该酶切割产物能够被T4DNA连接酶所连接,表面其切割产物具有3’OH和5’P末端。与野生型Tga NucS蛋白相比,D163A突变体蛋白不能够切割I-dsDNA,而E177A突变体蛋白的切割效率仅为18%。因此,D163为该酶的关键活性位点之一。结合实验结果显示,D163A突变体蛋白结合I-dsDNA的效率为68%,低于野生型Tga NucS蛋白的结合效率。另外,E177A突变体蛋白结合I-dsDNA的效率与野生型蛋白相接近。因此,D163同时参与该酶切割和结合dsDNA,而E177不参与该酶结合dsDNA,但会参与该酶切割dsDNA。本论文揭示了 Tba EndoV和Tga NucS切割I-DNA的生化性质,并初步探讨了Tga NucS的催化机理。本论文的研究成果,为阐明极端嗜热古菌DNA中次黄嘌呤的修复提供了重要的线索,也为揭示极端嗜热古菌中损伤DNA修复机制提供依据。