【摘 要】
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水体富营养化导致蓝藻水华频繁暴发,而蓝藻细胞破裂后会产生有毒的次生代谢物,危害着人类的健康。微生物在微囊藻毒素（microcystins,MCs）降解过程中起着重要作用,而MCs降解菌大多遵循mlr基因簇（mlr ABCD）机制。在过去的研究中,对于Mlr A、Mlr B、Mlr C的结构功能及降解机制的研究取得一定的成果,但是关于MlrD的研究甚少,因此对于MlrD的分子结构以及具体催化过程尚不
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水体富营养化导致蓝藻水华频繁暴发,而蓝藻细胞破裂后会产生有毒的次生代谢物,危害着人类的健康。微生物在微囊藻毒素（microcystins,MCs）降解过程中起着重要作用,而MCs降解菌大多遵循mlr基因簇（mlr ABCD）机制。在过去的研究中,对于Mlr A、Mlr B、Mlr C的结构功能及降解机制的研究取得一定的成果,但是关于MlrD的研究甚少,因此对于MlrD的分子结构以及具体催化过程尚不清楚。本文对Sphingopyxis sp.USTB-05中的MlrD进行研究,通过生物信息学手段进行分析预测,并进行同源性分析,构建MlrD分子结构;通过亚细胞定位实验确定MlrD蛋白的亚细胞位置;以及将MlrD在大肠杆菌中进行异源表达研究,为后期进一步开展MlrD深入研究奠定基础。主要研究结果如下:（1）对MlrD进行生物信息学分析表明,MlrD是一类具有良好热稳定性的碱性疏水蛋白,其亚细胞定位预测为细胞膜,属于膜蛋白且不存在信号肽。同源性分析知MlrD属于PTR2蛋白家族,存在PTR2结构域。系统发育树分析可知MlrD在进化过程中不仅遵循垂直遗传规律,还遵守水平遗传规律。通过同源建模的方法模拟出MlrD的三维分子结构,发现该结构主要由12个α-螺旋组成,N端和C端结构域之间的保守残基形成一个体积较大的反应间隙。（2）通过重叠PCR扩增法准确地将mlr D、egfp两段基因连接起来,并成功将融合基因构建到含有His标签的p ET-30a（+）载体上,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中,成功获得了重组菌USTB05-mlr D-egfp,实现了MlrD与EGFP在大肠杆菌BL21（DE3）中的融合表达。通过激光共聚焦显微镜进行观察结果显示:诱导表达3 h时,大部分的重组菌USTB05-mlr D-egfp中的细胞膜上可以观察到荧光,细胞质中没有荧光的出现,说明MlrD蛋白的表达部位在细胞膜上。（3）通过将从Sphingopyxis sp.USTB-05中得到的mlr D基因序列进行PCR扩增,将该序列与质粒p ET-30a（+）进行连接构建了重组质粒p ET-30a（+）-mlr D,最终将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,得到了重组菌USTB-05-mlr D。经过IPTG诱导的USTB-05-mlr D在50 k Da处有可见蛋白条带出现。本实验仅初步建立MlrD异源表达的方法,为后续进行MlrD异源过表达及进行系统性发酵条件优化的研究奠定一定基础。
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