目的:建立新型隐球菌血流感染动物模型,收集动物血浆和肺泡灌洗液标本,同时进行FQ-PCR、培养、墨汁染色、组织病理、乳胶凝集实验对照观察,探讨FQ-PCR检测体系在动物模型标本中DNA的诊断价值及与所选的四种比较方法的优选性,奠定临床真菌PCR检测试剂盒开发的基础,以实现真菌感染的早期临床诊治,降低临床真菌感染的病死率及治疗成本。方法:1实验研究方案:(1)标准株培养及制备,标准新型隐球菌接种于PDA平板37℃培养48小时后,用接种环刮取菌落溶于生理盐水放入已消毒的EP管中;通过血细胞计数板计数,制成细胞浓度约为106CFU/ml的混悬液,作为标准株储存液,置于-80℃冰箱备用。(2)动物模型,32只雄性SD大鼠,采用随机分配原则分为4组,同时称重,编号,分别笼养,按时提供食物和水。A组:免疫抑制感染组(n=10只):注射环磷酰胺(150mg/kg)溶液进行免疫抑制大鼠,尾静脉注射新型隐球菌菌悬液感染动物;B组:正常状态感染组(n=10),注射等量的生理盐水,模型建立后尾静脉注射新型隐球菌菌悬液感染动物C组:正常对照组(n=6):正常饲养;D组免疫抑制对照组(n=6);仅注射环磷酰胺(150mg/kg)溶液进行免疫抑制大鼠。A+B为实验组(感染后第3天全部处死),C+D为对照组(感染后第3天全部处死)。2统计学方法:全文在数据处理和分析中均采用SPSS20.0统计软件进行统计学处理,将采集的实验组和对照组动物的血清和支气管肺泡灌洗液标本FQ-PCR检测后结果进行比较。实验组不同天数与对照组先进行总体的χ2检验,当P<0.05,实验组与对照组差异有统计学意义。各实验组不同时间点与同一对照组进行两两比较,检验水准要调整为a--0.05/2(5.1),即当P<0.00625时,差异有统计学意义。结果:1免疫抑制感染组感染后24小时出现开始出现食欲差,活动减少,被毛失去光泽,鼠毛蓬乱,前足抱头身体呈弓形逐;正常状态感染组仅见3例食欲减低,活动少,对照组一般情况良好;2感染后第3天处死大鼠,取肺组织和其它脏器(肝、脾、脑)。实验组与正常对照组大鼠比较,肺组织密布隆起灰白色结节,脾稍大,其他脏器未见异常;3将正常鼠的血浆101CFU/ml混悬液进行1:1、1:2、1:3、1:4稀释,热带念珠菌标准株102CFU/ml混悬液进行1:1、1:2、1:3、1:4稀释,提取DNA后进行PCR扩增,重复8次。新型隐球菌标准株混悬液经1:1稀释后能完全扩增,而经1:2、1:3、1:4稀释后样本未见扩增或仅部分扩增,该四种反应体系能检测的灵敏度均可以达到105CFU/ml;4将收集的血清及肺组织提取DNA进行FQ-PCR检测,实验组阳性率较正常对照组和免疫对照组高,P<0.05,差异有统计学意义,随感染时问延长,阳性率逐渐上升,感染后8小时之前实验组FQ-PCR结果与免疫抑制和正常对照组差异均无显差异;5在FQ-PCR与血培养、荚膜抗原检测、墨汁染色四种对新型隐球菌检测的敏感性比较中,FQ-PCR验敏感性最高,其敏感性为100%,而荚膜抗原达96.2%,血培养敏感性最低,为58.8%,FQ-PCR技术在诊断新型隐球菌的敏感性方面明显高于血培养、墨汁染色、荚膜抗原实验(χ2=8.694,P=0.031);FQ-PCR技术在诊断新型隐球菌的特异性方面明显高于血培养、墨汁染色、荚膜抗原实验(χ2=12.129,P=0.021);6 101拷贝数/ul是FQ-PCR的最低检测出来的浓度,上述结果表明:通过采用实时荧光的方法利用定量PCR的对FQ-PCR灵敏度进行检测,其灵敏度为101拷贝数/ul;7在六种菌株中,只有新型隐球菌表现出明显的特异性扩增,剩余的五种菌株均没有发现有荧光曲线增长的现象,上述结果进一步说明FQ-PCR检测方法对新型隐球菌的检测具有较好的特异性;8分别将FQ-PCR检测所应用的质粒标准品中的109拷贝数/ul、107拷贝数/ul、105拷贝数/ul三个浓度定义为高、中、低,通过批内重复性检验,可见上述三类的CV值依次为0.59%、0.90%和1.19%,上述结果进一步说明FQ-PCR检测方法在检测新型隐球菌中具有很好的批内重复性。结论:1 FQ-PCR检测技术对于新型隐球菌具有较高的敏感性以及特异性2 FQ-PCR检测方法在检测新型隐球菌中具有很好的批内重复性;3 FQ-PCR检测技术可进行准确的定量检测,用于基因诊断,且定量范围宽,特异性更强,克服了假阳性。