论文部分内容阅读
离子通道是细胞膜上普遍存在的电兴奋分子。蝎毒素可以选择性地与膜上各离子通道相互作用,影响离子通道状态。多属β-类抗痛蝎毒素,能靶向结合在电压门控钠通道第四个位点上,通过电压传感器俘获机制特异性激活电压依赖性钠通道,使钠电流向复极化方向移动。由于天然状态下蝎毒素表达量较少,阻碍围绕蝎毒素相关的细胞膜离子通道的研究。因此本实验通过原核细胞外源表达的方法实现其功能性表达,并采用细胞学方法解析相关钠电流的变化及抗痛效应机制。1.抗痛蝎毒素多肽重组表达体系的构建表达重组蛋白的方法有很多,采用酿酒酵母、毕赤酵母等真核生物表达重组多肽,采用昆虫、哺乳动物细胞表达,原核细胞表达以大肠杆菌为主,容易培养价格低廉,较真核表达有较多优势。因此我们构建了蝎毒素多肽的原核细胞表达体系,使用pET-32a作为表达载体,pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白比较完善的表达系统。采用微生物培养大肠杆菌BL21(DE3)加IPTG诱导表达,逐步缩小时程并优化表达条件,确定初步纯化获得的粗蛋白产量约0.0885g/15ml。采用SDS-PAGE蛋白质电泳,western-blot免疫实验,AKTA蛋白纯化,HPLC色谱,动物实验,全细胞膜片钳记录等方法研究抗痛蝎毒素的细胞机制。(1)阳性重组子的筛选:将BmK-AS、BmK-AS1、BmK-IT2三个毒素基因片段使用BamHⅠ、XhoⅠ这两种限制性内切酶切出粘性末端,用T4 DNA连接酶将载体pET-32a与目的基因连接,转入TOP10菌种中保存,然后采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA,重组质粒比空质粒的分子大,跑电泳后表现出明显重组质粒滞后现象。用带氨苄青霉素抗性的SOB培养基筛选出成功导入的目的基因质粒的大肠杆菌,呈阳性菌株是用于表达毒素多肽的菌种。(2)IPTG诱导重组表达:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)与自然的β-半乳糖苷酶相似,不能被酶分解,性质稳定,是lac基因簇十分有效的诱导物,因此被广泛用在分子生物学与基因工程中。用微生物培养大肠杆菌加IPTG诱导法表达外源蛋白,每隔1小时取一次样,通过溶解、离心、破菌得到不同成分蛋白,电泳检测表达情况,确定各自的优化表达条件BmK-AS 37℃、6h,BmK-AS1 30℃、6h,BmK-IT215℃、8h。(3)重组多肽分离纯化:采用金属镍离子亲和柱和高效液相色谱法对毒素蛋白逐步纯化,色谱结果显示镍离子与三种重组毒素分子表面的亲和作用去除杂蛋白,用20mM、与250mM咪唑将目的蛋白洗脱下来并收集;HPLC响应峰较好条件下三种重组毒素使用流动相A和B比例:45%(1%三氟乙酸水溶液)和55%(60%的乙腈溶液)。2.重组蝎毒素抗痛多肽的抗痛效应及细胞机制通过行为学观察、膜片钳电生理记录,比较三种重组蝎毒素多肽的抗痛效应及细胞机制。采用膜片钳技术给大鼠DRG细胞上加入重组抗痛蝎毒素,记录其具有显著抑制钠电流的作用。在大鼠上测其镇痛效应,以1 mg/ml的剂量腹腔注射,发现大鼠有不同程度的疼痛缓解反应,通过大鼠对疼痛的抑制率来比较出各个毒素的镇痛作用大小。而这些差异可能与蝎毒素的序列、结构及其与钠通道互作相关。综上,蝎毒素是研究离子通道神经药理学的分子工具之一。本论文通过构建原核细胞外源表达系统,并优化出三种蝎毒素多肽的可溶性表达条件,实验证明这些蝎毒素多肽的具有的差异性抗痛活性。结果有助于推进蝎毒素天然状态低丰度表达、化学合成无活性、结构解析与改造等技术难题的解决,为进一步研究与疼痛相关膜离子通道结构与功能提供了一定的科学与技术基础。