研究背景单纯慢性牙周炎和2型糖尿病是危害人类健康的两大疾病。慢性牙周炎是一种慢性进行性炎症性疾病,2型糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病,而高血糖是由于胰岛素分泌缺陷或使其生物作用受损,或两者兼有引起。近年来,国内外学者再次对糖尿病促进牙周炎发生、发展的机制进行了探究,但由于菌斑生物膜及其他局部促进因素的参与、炎性细胞因子的多样性,尤其是以糖尿病作为全身因素参与下的牙周炎发病机制的复杂性,使得这一问题还远未解决。本研究拟探索2型糖尿病伴牙周炎的发生、发展是否由于糖基化终末产物和相关炎性介质来实现对牙周膜干细胞成骨能力的影响,以期对其发病机制进行更深入的探索。材料与方法健康组(H),单纯牙周炎组(P),糖尿病伴牙周炎组(D)牙周膜干细胞(PDLSCs)体外培养与鉴定健康组(H-PDLSC组):本实验组选择在第四军医大学口腔医院就诊因智齿异位萌出而需拔除的符合入选标准的男性患者20例,年龄平均30~39岁(平均33.9)。单纯牙周炎组(P-PDLSC组):选择在遵义医学院附属口腔医院就诊的20例需拔牙且符合入选标准的男性重度单纯牙周炎患者,年龄39~50岁(平均46.7岁)。2型糖尿病伴牙周炎组(D-PDLSC组):选择在遵义医学院附属医院内分泌科及口腔科会诊的20例需拔牙且符合入选标准的男性2型糖尿病伴重度牙周炎患者,年龄44~50岁(平均47岁)。修剪去除拔除牙的上皮组织和炎症肉芽组织,刮取牙根中1/3牙周膜组织,用PBS缓冲液及组织培养液交替冲洗、消化、离心,去上清后将组织平铺于6孔板中,加入含100ml/l胎牛血清的α-MEM培养液约2-3ml,置于含5%CO2的恒温箱中培养,37℃。分别从细胞形态学、细胞增殖、免疫细胞化学、流式细胞检测、相关基因蛋白水平变化及干细胞多项分化潜力等方面对三种PDLSCs进行检测、鉴定。体外模拟糖尿病伴牙周炎患者牙周PDLSCs微环境利用不同浓度的(1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)ages及(10ug/ml/ages+1ng/mltnf-α)体外刺激正常来源pdlscs,以模拟糖尿病和糖尿病伴牙周炎患者牙周pdlscs微环境,分别观察刺激后的pdlscs在细胞形态学、细胞增殖、alp活性、体外矿化能力以及相关基因蛋白水平发生的变化。dkk-1/licl和β-cateninsirna调节模拟牙周微环境状态下pdlscs的wnt通路相关因子水平变化分别利用wnt通路抑制剂/激动剂(100ng/mldkk-1/licl/100nmol/mlβ-cateninsirna调节pdlscs的wnt通路,检测调节后的pdlscs相关基因蛋白水平的变化。ptdc调节三组pdlscs及模拟糖尿病牙周微环境pdlscs的nf-κb通路相关因子水平变化利用ptdc调节三组pdlscs和模拟糖尿病牙周微环境pdlscs的nf-κb通路,分别检测调节后的pdlscs成骨相关基因蛋白和age/rage相关基因蛋白水平。将三组pdlscs、dkk-1/wnt3a诱导后pdlscs和载体陶瓷化骨(cbb)分别植入裸鼠的皮下。二月后组织学观察其成骨分化情况。结果牙周膜干细胞的分离、增殖和分化:(1)牙周膜干细胞的分离、培养与表面标志物鉴定:常规分离、培养的h-pdlsc,p-pdlsc和d-pdlsc各组均为长梭形、胞体丰满、纺锤状的成纤维样形状细胞,形态较一致;各组细胞免疫荧光检测结果显示,三组人来源牙周膜干细胞波形丝蛋白均为阳性表达,细胞角蛋白呈阴性表达;经image-proplus软件分析细胞表面分子stro-1和cd146标记情况:糖尿病伴牙周炎来源的d-pdlsc表型分子stro-1和cd146阳性细胞量表达较p-pdlsc和h-pdlsc低(p<0.05),stro-1表达阳性细胞的百分比分别为:62.8±1.8%(h-pldsc)、40.8±2.7%(p-pdlsc)和27.6±1.8%(d-pdlsc),差异具有统计学意义(p<0.05);cd146表达阳性细胞百分比分别为:69.8±3.9%(h-pldsc)、48.1±1.6%(p-pdlsc)和32.3±0.9%(d-pdlsc),差异有统计学意义(p<0.05),同时经流式细胞技术检测cd14、cd34、cd29、cd90、和stro-1等细胞表面分子进一步明确人牙周膜来源干细胞的间充质来源及其干细胞特性。(2)各组牙周膜干细胞克隆形成自我更新和增殖能力:h-pdlsc、p-pdlsc和d-pdlsc均具有一定的自我更新修复能力,各组细胞克隆形成率分别为:36.9±4.1%(h-pdlsc)、25.5±2.6%(p-pdlsc)和17.6±2.4%(d-pdlsc),d-pdlsc克隆形成率较p-pdlsc(p<0.05)和h-pdlsc均低(p<0.001),差异具有统计学意义(p<0.05);在连续7天的相同培养条件下,mtt法检测三种干细胞增殖情况是:d-pdlsc增殖能力弱于p-pdlsc和h-pdlsc,差异具有统计学意义(p<0.01),同时对三种牙周膜来源干细胞进行流式细胞周期检测结果显示,d-pdlsc的s+m期和g2/g1期细胞数量较少,进一步证实了d-pdlsc细胞增殖能力较p-pdlsc和h-pdlsc弱。(3)成骨、成脂分化能力比较:成骨、成脂诱导液分别对三组牙周膜来源干细胞诱导21天,经image-proplus软件分析发现:在相同视野下,h-pdlsc诱导后钙化结节形成量最多,p-pdlsc为其次,d-pdlsc最少,差异具有统计学意义;另外,诱导一周后,rt-pcr检测runx-2、alp、bsp、ocn和col-1成骨基因,结果发现d-pdlsc成骨相关基因表达较低,而成脂相关基因的表达无明显变化。同时以westernblot技术验证了rt-pcr结果。体外模拟糖尿病伴牙周炎患者牙周pdlscs微环境情况:(1)mtt检测结果显示:不同浓度梯度的ages对pdlscs增殖能力的影响有一定的差别,高浓度梯度(100ug/ml,200ug/ml)ages,明显抑制pdlscs的增殖能力,差异具有统计学意义(p<0.05),低浓度梯度(1ug/ml,10ug/ml)ages,对pdlscs的增殖能力影响不明显,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)牙周膜干细胞成骨诱导后钙化结节的形成:配制标准成骨诱导液诱导pdlscs,21天进行茜素红染色,对照组及实验组显微镜下观察,均可见钙化结节存在,利用十六烷基吡啶定量结果显示1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、200ug/mlages刺激实验组矿化能力均低于对照组牙周膜干细胞的成骨结节形成,高浓度200ug/mlages组矿化能力最低,差异均有统计学意义(p<0.05)。不同ages刺激浓度的实验组之间矿化能力比较差异有统计学差异(p<0.05),各实验结果显示,随ages浓度梯度升高,人牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨矿化能力逐渐降低。(3)alp染色:配制标准成骨诱导液诱导各组pdlscs,7天,alp试剂盒染色后发现对照组细胞颜色最深,1ug/mlages浓度刺激的牙周膜干细胞颜色次之,并且随着ages浓度增高,染色的颜色逐渐变浅,各实验组之间比较观察颜色有差异。(4)选择(10ug/mlages与1ng/mltnf-α)共同刺激pdlscs,7天,alp染色并提取各组细胞rna及蛋白,结果发现,ages/tnf-α共同刺激组alp染色较正常对照组和ages单独刺激组浅,而且成骨相关基因蛋白表达也低于其它两组。21天后茜素红染色结果显示,ages/tnf-α共同刺激组矿化结节形成量明显低于其它两组。wnt信号通路调控情况:(1)成骨诱导培养三组细胞,发现h-pdlscs和p-pdlscs组高表达dkk1,而d-pdlscs组表达并未增加。但将50ng/mldkk-1加入成骨诱导液共培养三组细胞,d-pdlscs+dkk-1组矿化结节形成增高,成骨相关基因蛋白也高于d-pdlscs组,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)体外ages模拟组和ages+dkk1组alp染色及定量均高于单纯ages刺激组,成骨相关基因蛋白表达也表现出一致趋势,差异有统计学意义(p<0.05)。ages+dkk1组rage表达较ages组低,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)利用β-cateninsirna转染pdlscs,72小时后利用westernbolt确定其转染效率。β-cateninsirna组pdlscs:alp染色及定量,成骨相关基因表达均高于对照组。并且β-cateninsirna能够下调ages体外刺激pdlscs的rage表达,但是对h-pdlscs或d-pdlscs无此影响。nf-κb的调控情况:对于p-pdlscs组和d-pdlscs组,活化的nf-κb表达要高于h-pdlscs组。pdtc能够使p-pdlscs组和d-pdlscs组的nf-κb表达降低,但只能够使p-pdlscs组中成骨相关基因表达升高,对d-pdlscs并无此改变。pdtc能够降低ages刺激组nf-κb表达,但是不能够上调runx2。此外,pdtc对ages刺激组alp染色和定量结果也不存在作用,rage也未受到pdtc的影响。5.组织学观察结果显示,d-pdlscs植入裸鼠皮下后,蓝色区面积均少于p-pdlscs和h-pdlscs,但是经过dkk-1诱导糖尿病伴牙周炎组的d-pdlscs所形成的蓝色区面积明显增加。结论体外成功进行了2型糖尿病伴牙周炎患者pdlscs的分离和培养,分别与健康和单纯牙周炎者的pdlscs进行比较,其增殖克隆能力、细胞干性和成骨分化能力都较低,但成脂分化能力没有明显差异。利用ages/tnf-α体外成功模拟糖尿病伴牙周炎微环境,pdlscs增殖和成骨分化能力随ages浓度增大而降低,并且ages能够加大tnf-α对pdlscs的影响。tnf-α刺激pdlscs可以使其rage表达增高,但是rage在ages培养环境中无变化。dkk1能够减轻糖尿病伴牙周炎微环境及ages刺激pdlscs成骨分化能力的影响,且能够降低ages刺激组rage的表达。β-cateninsirna对活性β-catenin的抑制能够提高d-pdlscs和ages刺激组成骨相关基因表达,且能够降低ages刺激组rage的表达,表明wnt通路的激活与糖尿病伴牙周炎和体外模拟糖尿病微环境状态下pdlscs成骨能力呈负相关。通过对三组细胞NF-κB通路相关指标及利用PTDC调节检测,发现糖尿病状态下PDLSCs成骨能力与RAGE表达及NF-κB通路无直接关联。体内验证结果进一步表明2型糖尿病伴牙周炎来源的PDLSCs骨向分化能力明显不足,而Wnt经典通路抑制剂DKK-1能促进2型糖尿病伴牙周炎来源的PDLSCs成骨能力。综上所述,及本实验结果表明,在糖尿病致牙周炎的发生和发展中,Wnt信号通路可能介导AGEs和TNF-α来影响牙周膜干细胞骨向分化过程,WNT通路的抑制能够使PDLSCs骨向分化能力增强。本研究结果提示不仅可以通过Wnt信号通路的调控来干预糖尿病炎症微环境作用下牙周膜干细胞的骨向分化能力,而且使DKK1或一些小分子化合物作为治疗糖尿病伴牙周炎患者的有效药物存在可能性,为进一步寻求糖尿病伴牙周炎症治疗的新策略提供新的理论和实验依据。