脂肪或肌肉组织中的脂肪和脂肪酸成分,对肉的外观、质地、风味、硬度和保质期等都有积极影响,是肉类营养价值的核心,并且也是影响动物生产的一个重要组成部分。因此,阐明脂肪生成的调控机制对于提高肉品质具有重要意义。脂肪生成是由一系列转录因子参与的复杂而精细的程序化调控过程,目前对这一生物学路径已有了较为清晰的认识,众多研究显示以生脂调节因子PPARγ和C/EBPα为核心的信号转导网络在这一过程中起着关键作用。但是,脂肪生成涉及多基因的表达、信号转导及网络调控,过程比较复杂,不断有新的调控因子被鉴定。近年来的研究显示,长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lnc RNAs)对于脂肪生成也具有重要的调控作用,但是这方面的研究还比较少,许多调控机制还不明确,在家畜上更是未见报道。因此,本研究利用去除核糖体RNA高通量测序技术分析了牛脂肪细胞分化前后表达的lnc RNAs,并利用c DNA末端快速扩增、RNA荧光原位杂交、基因过表达、RNA干扰、双荧光素酶报告系统、基因定点突变等技术深入探讨了lnc RNA ADNCR调控牛脂肪细胞分化的机制。主要研究结果如下:1.lnc RNA ADNCR在脂肪细胞分化前后下调程度最大本研究对秦川牛脂肪细胞分化前后进行去除核糖体RNA高通量测序,共得到约3.93亿clean reads,89.7%以上的reads可以比对到牛参考基因组上,52%的reads位于基因间区或内含子区域,说明基因间区和内含子区域中包含大量未被注释的转录序列。经过一系列严格的筛选,如长度≥200 bp、外显子数目≥2、reads≥3,与已知蛋白数据库比对,编码能力预测等,共鉴定到2,882个lnc RNAs,其中包括1,037个新lnc RNAs。基因组特征分析表明基因间型lnc RNAs所占比例最高,达55%,反义型lnc RNAs含量最少,仅占总量的4%;各染色体所编码的lnc RNAs数目与其长度大致呈正比;lnc RNAs的编码潜能、长度、外显子数目和表达丰度均低于m RNA;序列保守性分析表明lnc RNAs的保守性虽然低于编码基因,但却明显高于随机序列,说明lnc RNAs具有一定的保守性,在物种进化过程中发挥着必要的功能。差异表达分析揭示有16个lnc RNAs在脂肪细胞分化前后差异表达,其中lnc RNA ADNCR的下调程度最大。2.ADNCR通过竞争性结合mi R-204抑制牛脂肪细胞分化ADNCR全长1,730 nt,位于牛13号染色体上,具有两个外显子,在物种间序列保守性较差;生物信息学预测和体外翻译试验均表明ADNCR符合长链非编码RNA的特征。细胞核和细胞质RNA分析以及RNA FISH试验显示ADNCR主要在细胞质中表达。过表达ADNCR能抑制脂肪生成,下调脂肪细胞分化标志性基因PPARγ、C/EBPα和FABP4表达。在线软件RNAhybrid预测发现,在ADNCR的205-250和1630-1659碱基处有两个mi R-204的结合位点,机制分析揭示ADNCR能够作为竞争性内源RNA吸附mi R-204,阻止mi R-204对其靶基因SIRT1的抑制作用,增加脂肪细胞中SIRT1表达量,使SIRT1与转录共抑制因子NCo R和SMRT结合,降低PPARγ活性,从而抑制脂肪生成。ADNCR-mi R-204-SIRT1的这种交互作用丰富了对脂肪生成的了解,为解析脂肪生成的调控机制提供了新的思路。3.白藜芦醇和烟酰胺通过SIRT1调控牛脂肪细胞分化鉴于SIRT1在机体代谢、脂肪细胞分化和肌肉发育中的重要作用,我们分析了SIRT1激活剂和抑制剂(白藜芦醇和烟酰胺)对脂肪生成的调控作用。白藜芦醇能够抑制前体脂肪细胞增殖,阻碍脂肪细胞脂滴积累,降低脂肪细胞分化标志性基因PPARγ和C/EBPα表达;而烟酰胺对脂肪细胞的增殖和分化则都具有促进作用。q RT-PCR表明白藜芦醇和烟酰胺对脂肪细胞分化的调节作用不仅涉及到脂肪生成基因,并且还涉及到脂肪酸氧化利用基因。当利用sh RNA干扰掉SIRT1后,烟酰胺不能进一步增加脂肪细胞分化,说明烟酰胺依赖于SIRT1调控脂肪生成。4.SIRT1启动子区SNPs调节其活性利用DNA混合池测序,在五个中国牛品种的SIRT1基因中鉴定到5个新的SNPs位点;与南阳牛的生长性状关联分析表明,这5个SNPs与部分体尺性状显著相关。启动子活性分析表明,SNPs g.-382G>A和g.-274C>G均位于SIRT1基因的启动子核心区域,能降低SIRT1的启动子活性;在线软件Mat Inspector Release professional 8.0预测表明SNP g.-382G>A产生了一个转录因子MEF2A的结合位点,将pc DNA-MEF2A和不同基因型的SIRT1启动子片段共转染C2C12细胞表明,过表达MEF2A会造成AA基因型SIRT1的转录活性下降,并且在秦川牛的背最长肌、半腱肌和肝脏等组织中AA基因型SIRT1的表达量也较低。表明MEF2A可以结合到等位基因A上,从而降低SIRT1启动子活性,抑制其表达。本研究丰富了牛的基因组注释,为后续开展lnc RNAs对脂肪的调控研究提供了宝贵资源,并且也为解析脂肪细胞分化的机制提供了新的思路,对揭示秦川牛优异肉质性状遗传基础、推进我国专门化肉牛品种培育、提高畜牧业竞争力等都具有重要的理论意义。