研究背景肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果,与慢性肾功能衰竭进展密切相关,是导致终末期肾病的主要病因。肾间质纤维化常伴有肾小管萎缩、间质炎性细胞浸润、成纤维细胞聚积以及间质基质沉积等特征性病理改变。迄今为止,肾间质纤维化的分子机制尚未完全阐明,而且缺乏有效的治疗措施来阻止肾间质纤维化的进展。因此,深入的了解肾间质纤维化的发病机制,有助于找到肾间质纤维化新的治疗靶点以及制定新的治疗策略。脂肪源性干细胞(ADSCs)是一种具有自我更新和多向分化功能的间充质干细胞,ADSCs可以分化为不同的细胞,比如足细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞等。ADSCs同样拥有治疗多种疾病的潜力,比如自身免疫性疾病、糖尿病、移植物抗宿主病、气管纵隔瘘、多发性硬化。与骨髓干细胞相比,ADSCs具有两个特殊优点。首先,ADSCs可以很容易的从大量皮下脂肪获取,对身体损伤相对小;其次,ADSCs没有免疫原性,可以从自身脂肪组织提取,可以避免伦理问题。以上两个特点,使得ADSCs成为组织和器官再生医学以及临床应用的理想的热门材料。新近的研究证实,ADSCs可以通过减轻炎症和抑制免疫反应从而减轻肾脏的损伤。比如,ADSCs通过抑制趋化因子和细胞因子的表达而起到减轻小鼠急性肾损伤的作用;ADSCs对脓毒血症模型大鼠急性肾损伤具有保护作用;ADSCs通过抑制氧化应激、抗凋亡和抑制炎性细胞因子等机制,减轻大鼠肾脏的缺血再灌注损伤。然而,ADSCs能否治疗肾间质纤维化?以及其具体的分子机制如何?目前尚不清楚。本研究通过建立大鼠肾脏纤维化模型来探讨ADSCs对肾间质纤维化的改善作用及其机制。第一部分ADSCs通过抑制肾小管上皮-间质转化(EMT)改善UUO大鼠肾间质纤维化目的探讨ADSCs对UUO大鼠肾小管上皮细胞EMT和间质纤维化的影响及其可能的机制。方法体外分离培养鉴定大鼠脂肪来源的ADSCs并用绿色荧光蛋白(GFP)进行体外标记。45只雄性Wistar大鼠,分为3组,各15只:(1)单侧输尿管梗阻组,称UUO组。大鼠行左侧输尿管结扎,术后7天尾静脉注射生理盐水1ml;(2)单侧输尿管梗阻+细胞移植组,称UUO+ADSCs组,大鼠行左侧输尿管结扎术,术后7d尾静脉注射5×106 ADSCs;(3)正常对照组,称Sham组,手术入路方式同UUO组,进入腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管,术后7d尾静脉注射生理盐水1ml。为了示踪干细胞移植后在肾脏内的分布,另有8只UUO大鼠于手术后当天经尾静脉注射转染GFP的ADSCs。术后第14天处死动物留取血和肾组织标本。应用自动分析仪测定血肌配和尿素氮水平。HE、Masson染色评估肾间质纤维化程度。用免疫组化法测定肾组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),成纤维细胞特异蛋白1(FSP-1),纤连蛋白(FN)和E钙粘蛋白(E-cadherin)水平表达变化。应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法分别检测肾组织中α-SMA、FSP-1、FN和E-cadherin的基因水平和蛋白水平的表达。结果1.ADSCs形态学观察与鉴定显示大鼠脂肪来源的ADSCs具有典型的成纤维细胞形态,贴壁生长,在适当的培养环境下可向脂肪细胞和成骨细胞分化,表达 CD29,CD90,CD44,不表达 CD34,CD45,CD11b。2.ADSCs肾脏内示踪显示ADSCsGFP移植后24h,在肾小球及附近的血管可以观察到少量的ADSCsGFP,但在移植后8周,仅在肾小球中发现极少的ADSCsGFP细胞。3.手术后第14天,Sham组、UUO组与UUO+ADSCs组血肌酐、尿素氮无显著差异(p>0.05)。4.HE、Masson染色结果显示,Sham组大鼠肾脏组织学正常,UUO组大鼠可见严重肾间质纤维化,包括肾小管扩张、萎缩以及小管上皮细胞空泡变性,肾间质大量炎症细胞浸润。经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs组较UUO组肾间质纤维化程度明显减轻(p<0.05)。5.免疫组化结果显示,UUO组α-SMA、FSP-1和FN表达较Sham组明显增加,E-cadherin表达较Sham组明显减少(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs 组较 UUO 组 α-SMA、FSP-1 和 FN 表达明显减少,E-cadherin 表达明显增加(p<0.05)。6.实时荧光定量 RT-PCR 和 Western blot 显示,UUO 组 α-SMA、FSP-1 和FN表达较Sham组明显增加,E-cadherin表达较Sham组明显减少(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs组较UUO组α-SMA、FSP-1和FN表达明显减少,E-cadherin 表达明显增加(p<0.05)。结论ADSCs可以减轻单侧输尿管梗阻模型大鼠早期肾间质纤维化程度和肾小管上皮-间充质细胞转化,该作用可能与ADSCs下调肾间质α-SMA、FSP-1和FN表达,上调E-cadherin表达有关。第二部分ADSCs通过抑制炎症反应改善UUO大鼠肾间质纤维化目的观察ADSCs对UUO大鼠间质炎症反应的影响,探讨ADSCs延缓肾间质纤维化进展的机制。方法实验分组及组织标本收集同第一部分。采用免疫组化法测定肾组织中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),Toll样受体4(TLR4),肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表达。实时荧光定量RT-PCR检测MCP-1,TLR4,TNF-α,IL-1β和IL-6基因水平表达变化。结果免疫组化及实时荧光定量RT-PCR结果显示,UUO组MCP-1,TLR4,TNF-α,IL-1β和IL-6表达较Sham组明显增加(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs组较 UUO 组 MCP-1,TLR4,TNF-α,IL-1β 和IL-6 表达明显减少(p<0.05)。结论ADSCs可以减轻UUO大鼠早期肾间质纤维化程度,该作用可能与ADSCs抑制UUO大鼠肾脏间质炎症反应有关。第三部分ADSCs改善UUO大鼠肾间质纤维化的分子机制目的探讨ADSCs是否可以通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抗UUO大鼠肾间质纤维化方法实验分组及组织标本收集同第一部分。采用免疫组化法检测各组肾组织中TGF-β1蛋白表达。实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、Smad7基因水平的表达。Western blot 方法检测各组大鼠肾组织中 TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果1.免疫组化结果显示,UUO组TGF-β1表达较Sham组明显增加(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs组较UUO组TGF-p1表达明显减少(p<0.05)。2.实时荧光定量RT-PCR结果显示,UUO组TGF-β1表达较Sham组明显增加,Smad7表达较Sham组明显减少(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs组较UUO组TGF-β1表达明显减少,Smad7表达明显增加(p<0.05)。3.Western blot 结果显示,UUO 组 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 表达较 Sham组明显增加,Smad7表达较Sham组明显减少(p<0.05);经ADSCs治疗后,UUO+ADSCs 组较 UUO 组 TGF-β1、p-Smad2 和 p-Smad3 表达明显减少,Smad7表达明显增加(p<0.05)。结论ADSCs能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路而改善UUO大鼠肾间质纤维化。