目的:1.重组蛋白CC16的诱导表达和纯化。2.观察r CC16蛋白质对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症介质表达的抑制作用。3.研究重组CC16蛋白质对COPD小鼠模型肺部炎症反应的作用及其对支气管灌洗液中与血清IL-6、TNF-a、IL-8、IL-1β表达的影响。4.研究重组CC16蛋白质对COPD模型组肺组织气道上皮中CC16、NF-κB、MMP-9、TIMP-1、ICAM-1表达的影响。方法:1.将成功构建的p ET-30a(+)-r CC16重组质粒转入感受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达,Ni+-NTA树脂亲和纯化,Western blotting检测分析纯化的重组CC16蛋白。去内毒素后得到实验用的重组r CC16蛋白质。2.通过检测PLA2的活性,从而判断r CC16蛋白质是否具有生物活性。将不同浓度(0、0.5、1、2.5μg/m L)的重组CC16作用于小鼠巨噬细胞(RAW264.7),共同培养1、2、3、4、5天,通过CCK-8检测RAW264.7细胞的增殖,明确重组r CC16对RAW264.7细胞的毒理作用。3.不同浓度重组CC16(0、0.5、1、2.5μg/m L)预干预RAW264.7细胞2小时后,LPS(0.1μg/m L)刺激RAW264.7细胞,24小时后收集上清,采用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白水平。4.采用被动吸入香烟烟雾结合鼻腔滴入LPS法复制小鼠COPD模型,实验组小鼠给予不同浓度重组r CC16蛋白质(1、2.5μg/m L体重r CC16,即低剂量组与高剂量组)进行滴鼻干预,1月后行HE染色观察r CC16干预组小鼠肺组织的病理变化,进而检测重组r CC16对COPD是否有干预作用。收集COPD小鼠和r CC16干预组小鼠BALF和血清,ELISA方法检测TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表达,明确重组CC16对COPD小鼠炎性介质表达的干预作用。5.取COPD小鼠和r CC16干预组小鼠的肺组织切片,免疫组织化学法检测CC16、NF-κB、MMP-9、ICAM-1、TIMP-1的表达,进一步明确重组CC16对COPD小鼠的的干预作用及可能的机制。结果:1.SDS-PAGE结果显示,获得纯度高于95%的重组r CC16蛋白质;Western blotting结果表明,r CC16可被抗CC16抗体特异性的识别。2.(1)0.5μg/m L r CC16可抑制PLA2的活性,且随着r CC16剂量的增加(1.0、2.0μg/m L),抑制作用越明显。提示获得的r CC16具有生物活性。(2)5μg/m L以下剂量r CC16对RAW264.7细胞增殖及活力无明显影响。5μg/m L剂量组细胞的吸光度值明显降低,提示该剂量的r CC16对RAW264.7细胞的增殖有抑制作用。3.不同浓度重组CC16(0、0.5、1、2.5μg/m L)干预RAW264.7细胞2小时后LPS(0.1μg/m L)刺激RAW264.7细胞24小时,收集上清,ELISA检测结果:(1)LPS刺激RAW264.7细胞24 h后,收集细胞上层培养液,检测TNF-α含量:LPS组相比照组明显升高(对照组:85.76±13.41 ng/L,LPS组:443.77±20.70 ng/L)(P<0.01)。预先给予不同浓度的重组r CC16干预后,检测LPS刺激RAW264.7细胞24h后上清液中TNF-α含量:与LPS组相比,r CC16(1.0μg/m L、2.0μg/m L)组明显降低(1.0μg/m L组:372.73±25.38 ng/L,2.0μg/m L组:357.02±24.84 ng/L)(P<0.01),且随着r CC16剂量的增加TNF-α含量减少的越明显。(2)LPS刺激RAW264.7细胞24 h后,收集细胞上清液,检测IL-8含量:LPS组相比对照组明显升高(对照组23.55±8.55 pg/m L,LPS组82.66±9.76 pg/m L)(P<0.01)。预先给予不同浓度的重组r CC16干预后,检测LPS刺激RAW264.7细胞24h后上清液中IL-8含量,与LPS组相比,2.0μg/m L r CC16干预组IL-8表达下降(60.30±8.09 pg/m L)(P<0.05),其余两组则没有统计学意义(0.5μg/m L组:76.34±8.34 pg/m L,1.0μg/m L组:69.03±10.45 pg/m L)(P>0.05)。(3)LPS刺激RAW264.7细胞24 h后,收集细胞上清液,检测IL-6含量:LPS组相比对照组明显升高(对照组21.02±6.00 pg/m L,LPS组128.96±5.94 pg/m L)(P<0.01)。预先给予不同浓度的重组r CC16干预后,检测LPS刺激RAW264.7细胞24h后上清液中IL-6含量:与LPS组相比,各剂量组均可以降低LPS诱导的IL-6的表达,(0.5μg/m L组:111.27±6.37 pg/m L,P<0.05;1.0μg/m L组:95.22±10.63pg/m L,P<0.01;2.0μg/m L组:57.38±14.26 pg/m L,P<0.01)。(4)LPS刺激RAW264.7细胞24 h后,收集细胞上清液,检测不同剂量r CC16对IL-1β的影响,结果显示,各剂量组均无对IL-1β的表达无作用(对照组:17.46±1.09 ng/L,LPS组:21.08±4.16 ng/L,0.5μg/m L组:16.44±1.73 ng/L,1.0μg/m L组:16.33±1.41 ng/L,2.0μg/m L组:15.36±1.79 ng/L,P值均大于0.05)。4.采用被动吸烟联合鼻腔滴入LPS法复制小鼠COPD模型,同时给予不同浓度重组r CC16(1、2.5μg/g体重r CC16,即低剂量组与高剂量组)进行滴鼻干预,未干预组和PBS滴鼻组作为实验对照。(1)HE染色结果显示:COPD小鼠模型组其肺泡的完整结构出现明显的破坏,进而聚集融合形成了较大的肺大泡,气道黏膜褶皱增多,纤毛脱落,官腔变窄。应用重组r CC16蛋白质干预后,上述症状有所改善。肺大泡的形成较COPD组明显减少,官腔逐渐恢复正常形态,且高剂量组较低剂量组的作用明显。(2)收集肺泡灌洗液和血清,ELISA方法检测TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表达。结果显示:与正常对照组相比较,COPD组模型组血清和灌洗液中的TNF-α含量明显升高(正常组血清:61.12±13.37 ng/L,正常组灌洗液:67.57±18.03 ng/L,COPD组血清:116.04±12.10 ng/L,COPD组灌洗液:138.69±19.74 ng/L)(P<0.05)。给予不同浓度的重组r CC16干预后,高剂量组血清中的TNF-α与COPD组相比较含量明显减少(高剂量组血清:66.37±18.50 ng/L)(P<0.01);灌洗液中TNF-α的含量与COPD组相比较含量明显减少(灌洗液低剂量组:109.05±10.94ng/L,灌洗液高剂量组:97.55±17.76 ng/L)(P<0.01),且随着r CC16浓度的增加,TNF-α含量减少;与正常对照组相比较,COPD组血清和灌洗液中的IL-6含量明显增多(正常组血清:69.12±5.21 pg/m L,正常组灌洗液:20.70±5.23 pg/m L,COPD组血清:179.90±9.46 pg/m L,COPD组灌洗液:69.04±9.64 pg/m L)(P<0.01)。给予不同浓度的重组r CC16干预后,结果显示,灌洗液中和血清中的IL-6与COPD组相IV比较均有统计学意义(灌洗液低剂量组:51.28±11.94 pg/m L,灌洗液高剂量组:43.04±8.63 pg/m L:血清低剂量组:146.80±8.58 pg/m L,血清高剂量组:106.64±5.26 pg/m L)(P<0.05),且随着r CC16浓度的增加,IL-6含量减少;与正常对照组相比较COPD组血清和灌洗液中的IL-8含量明显升高(正常组血清:96.35±9.70 pg/m L,正常组灌洗液:63.54±7.69 pg/m L,COPD组血清:157.60±19.31pg/m L,COPD组灌洗液:133.25±7.29 pg/m L)(P<0.01)。给予不同浓度的重组r CC16干预后,灌洗液中IL-8与COPD组相比较均有统计学意义(灌洗液低剂量组:89.24±9.25 pg/m L,灌洗液高剂量组:62.07±6.75 pg/m L)(P<0.01),且随着r CC16浓度的增加,IL-8含量减少。血清中IL-8与COPD组相比,高剂量组有统计学意义(血清高剂量组:113.73±5.75 pg/m L);与正常对照组相比较COPD组血清中的IL-1β含量明显升高(正常组血清:91.02±9.82 pg/m L,COPD组血清:118.49±15.18 pg/m L)(P<0.01)。给予不同浓度的重组r CC16干预后,灌洗液中和血清中的IL-1β与COPD组相比较均没有意义(血清低剂量组:116.96±8.42 ng/L,血清高剂量组;109.90±6.79 ng/L灌洗液低剂量组:127.99±18.47 ng/L灌洗液高剂量组:118.15±10.96 ng/L)(P>0.05)。5.免疫组化:小鼠肺组织气道上皮中CC16、MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表达水平用灰度值表示,灰度值越大,表达水平越低。小鼠肺组织气道上皮中NF-κB p65的表达用入核阳性细胞数/细胞总数所得的百分比表示,百分比越大,入核表达越强。COPD组的小鼠肺组织气道上皮中的CC16的含量较正常组明显减少(正常组平均灰度值为178.61±1.58,COPD组平均灰度值为196.05±2.30)(P<0.05)。而COPD组中的MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表达较正常组均高。差异均具有统计学意义(正常组MMP-9平均灰度值:201.08±3.03,COPD组MMP-9平均灰度值:148.17±2.12;正常组TIMP-1平均灰度值:206.09±1.93,COPD组TIMP-1平均灰度值:176.27±1.79;正常组ICAM-1平均灰度值:193.67±2.88,COPD组ICAM-1平均灰度值:176.35±1.94)(P<0.05)。随着r CC16的干预,高剂量组干预组肺组织中的CC16的含量有所增加(高剂量组平均灰度值:181.59±3.12,P<0.01),MMP-9的表达随着r CC16浓度的增加而下降,呈现一定的剂量依赖关系(低剂量组:164.93±1.92,高剂量组:178.77±2.38,P<0.05);TIMP-1、ICAM-1的表达随着r CC16的干预较COPD组有所减少,但高剂量组与低剂量组没有差异(低剂量TIMP-1组:197.43±2.04,高剂量TIMP-1组:195.03±2.21;低剂量ICAM-1组:190.82±3.87,高剂量ICAM-1组:186.69±3.12,P>0.05)。与正常相比较,COPD组小鼠肺组织气道上皮中NF-κB p65发生了核转移,入核明显增多(正常组:20.32±1.98,COPD组:48.02±4.70,P<0.05),随着r CC16的干预,干预组肺组织细胞核中的NF-κB p65含量减少,且有一定的剂量依赖关系,差异具有统计学意义(低剂量组:38.92±3.27;高剂量组:31.79±2.02,P<0.05)。结论:1.纯化的重组r CC16蛋白质具有生物活性,5μg/m L的浓度以下对细胞的活力没有明显的影响。2.r CC16可以抑制由LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的细胞炎症介质TNF-α、IL-6,高剂量下对IL-8有抑制作用,但对于IL-1β则没有明显的作用。3.(1)r CC16治疗组与COPD组相比肺大泡的形成,气道黏膜褶皱增多,纤毛脱落,管腔变窄等问题均有所改善,且高剂量较低剂量的作用明显。(2)r CC16可以抑制肺泡灌洗液和血清中的TNF-α、IL-6及灌洗液中IL-8的表达,高剂量的r CC16可以抑制血清中IL-8的表达。提示r CC16具有抗炎作用。(3)r CC16治疗组与COPD组相比,小鼠肺组织气道上皮中的TIMP-1、MMP-9、ICAM-1的表达明显减少,CC16的表达增多,NF-κB p65入核也有所减少。提示r CC16的抗炎作用可能依赖于NF-κB信号通路。