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目的：
谷氨酸受体广泛分布在中枢神经系统内,谷氨酸受体分为两类:亲离子型受体和亲代谢型受体,亲离子型受体对节律性呼吸的影响现已明了,但是关于代谢性谷氨酸受体对基本节律性呼吸的调节机理目前仍旧不明了。故本实验选取其中Ⅱ组代谢性谷氨酸受体为研究对象,拟通过观察Ⅱ组代谢性谷氨酸受体对新生大鼠离体延髓脑片标本面神经后核内侧区(the medial region of the nucleusretrofacialis,mNRF)呼吸节律性放电活动的影响来探讨该受体在基本节律性呼吸发生和调节中的可能作用。
1)应用新生大鼠离体延髓脑片标本,记录与之相连的舌下神经呼吸节律性放电活动(respiratory rhythmical discharge activity,RRDA),观察受体特异性拮抗剂和激动剂对RRDA的影响,从而探讨Ⅱ组mGluRs在节律性呼吸产生和调节中的作用；2)在新生大鼠离体延髓脑片标本上,同步记录舌下神经根和mNRF区的吸气神经元(inspiratory neurons,Ⅰ-neurons)细胞外的放电活动,观察受体特异性拮抗剂,激动剂对吸气神经元放电活动的影响,进一步探讨该受体在基本节律性呼吸发生和调节中的可能作用。
方法：
选用新生SD大鼠(0～3d),雌雄不拘。参照并改良Suzue的方法制作离体延髓脑片标本,该脑片结构中主要包含面神经后核内侧区,前包氏复合体(Pre-B(o)tzinger Complex,PBC),腹侧呼吸组(ventral respiratory group,VRG)以及舌下神经核,并完整保留舌下神经根。1)用玻璃吸附电极记录舌下神经根放电作为呼吸活动的指标。实验动物分为3组:第1组(不同浓度的APDC组)将 APDC配成10、20、50μmol/L,标本随机分为Ⅳ小组(n=6),稳定记录舌下神经根节律性放电后,Ⅰ组为对照组,灌流MKS液,Ⅱ-Ⅳ组为实验组,依次分别灌流APDC10、20、50μmol/L,持续灌流15min,依次记录改灌前,改灌后1min,5min,10min舌下神经根RRDA的变化,并作出 APDC对RRDA的影响的量效曲线,选择观察最佳时间和最佳药物浓度。第2组(EGLU组)该组为6只SD新生乳鼠,方法同上,稳定记录舌下神经根的放电活动后,将此段作为对照组,以300μmol/L EGLU持续灌流15 min,观察改灌前及改灌后10min时RRDA中各项指标的变化。第3组(APDC和APDC+EGLU组),该组为6只新生鼠,方法同上,稳定记录舌下神经根放电活动后,以此段为对照,先加入50μmol/L APDC灌流10min,后加入50μmol/L APDC+300μmol/L EGLU持续灌流10min,分别记录各时间点对RRDA各项指标的影响；2)同步记录舌下神经根和mNRF吸气神经元细胞外放电活动,为了记录呼吸神经元,以微操纵器固定玻璃微电极,并通过控制微推进器作延髓面神经后核内侧区细胞外记录,记录时,每次推进10μm,直到记录到与脑片舌下神经根呼吸节律性放电具有位相关系的细胞外放电我们定义为吸气神经元放电(inspiratory neuron,I-neurons)。待稳定记录到吸气神经元的放电活动后,先以50μmol/L APDC灌流脑片10 min,洗脱APDC,待放电基本恢复后,再以300μmol/L EGLU灌流10min。通过灌流给药,观察给药前后不同药物对吸气神经元放电活动的影响。
结果：
1.Ⅱ组代谢性谷氨酸受体对延髓脑片呼吸节律性放电活动的影响:
1)灌流不同浓度的APDC(10,20,50μmol/L)记录灌流前,灌流后1min,5min,10min,各时间点RRDA的变化。不同的浓度组加药后随着时间的延长RC,TE逐渐延长,加药前RC,TE最短,第10min后达最长,提示给予APDC后对RRDA中RC,TE的抑制作用随时间延长而增加；同时加药后随时间延长TI缩短,IA降低,10min达最明显(RC:F=3.388,P=0.038),(TE:F=3.738,P=0.028),(IA:F=4.371,P=0.016),(TI:F=4.851,P=0.011)。不同时间点各浓度组之间比较:随着APDC浓度的增大,RC,TE逐渐延长,50μmol/L时最明显,同时TI,IA也随着浓度的增加而缩短,降低,在50μmol/L时达最大。在50μmol/L灌流10min后,RC,TE分别显著延长45.66％,50.21％,TI缩短25.49％,IA降低18.30％(P<0.05)。用300μmol/L EGLU灌流脑片10 min,与MKS灌流对照比较,RC和TE分别缩短了16.73％、17.43％,有统计学差异(P<0.05),TI缩短、IA减小,但两者与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。
2)APDC和APDC+EGLU对舌下神经根RRDA的影响:用50μmol/LAPDC灌流10 min后,与MKS灌流对照比较,RC、TE延长,IA降低,TI缩短,有统计学差异(P<0.05)；洗脱后改用APDC+EGLU灌流10 min后,各项指标与单独使用APDC灌流10min比较,RC、TE均显著缩短(P<0.05),且逐渐恢复至正常,而TI,IA变化无统计学意义(P>0.05)。
2.Ⅱ组代谢性谷氨酸受体对延髓脑片I-neurons放电活动的影响(即APDC和EGLU对I-neurons放电活动的影响):对照MKS灌流,给予50μmol/L APDC灌流后,吸气神经元放电的RC、TE分别延长了44.72％,48.64％,TI缩短了23.76％,IA降低了20.31％,PFn减少了32.95％,洗脱后改灌300μmol/L EGLU,与对照组相比,RC缩短26.54％,TE缩短27.87％,PFn增加了33.95％,而TI、IA均无显著性变化(TI,P=0.152；IA,P=0.178)。
结论：
以上结果提示,在新生鼠离体延髓脑片标本上:
1)Ⅱ组代谢性谷氨酸受体参与了基本节律性呼吸的调节；
2)Ⅱ组代谢性谷氨酸受体对mNRF区吸气神经元放电具有调节作用；
3)Ⅱ组代谢性谷氨酸受体对舌下神经根呼吸节律性放电的调节可能是通过对mNRF吸气神经元的调节实现的。