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物种组成鉴定研究是中成药质量评价体系的关键问题之一。传统中成药质量评价方法包括性状鉴别、显微鉴别、理化技术等,对于形态相似的近缘物种和含有相同化学成分的物种难以区分,制剂中未知有毒有害或者濒危珍稀物种成分无法检测,因此,有必要结合分子生物学方法鉴定中成药复杂的物种组成信息。马兜铃酸类物质(AAs)由于具有不可逆转的肾脏毒性被列为Ⅰ级致癌物,主要来自马兜铃属、细辛属等马兜铃科植物。目前,一些含AAs植物仍作为传统药物使用,对公众健康的获益—风险评估值得关注。本论文首先选取2015年版《中国药典》收载的两种含马兜铃科植物的清肺化痰中成药——儿童清肺丸和止嗽化痰丸为研究对象,结合分子生物学及化学方法,以期建立一种准确、有效的中成药物种组成鉴定研究方法;然后,采取相关分子生物学技术——TaqMan探针实时荧光PCR法,验证重要组分是否存在,并以冬虫夏草及易混品,泽泻及近缘物种东方泽泻为例开展方法测试研究。主要研究内容及结果如下:1.建立二代测序技术、TaqMan探针实时荧光PCR技术和液质联用技术相结合的方法,开展中成药儿童清肺丸的物种组成鉴定研究。二代测序结果显示,除法半夏、橘红、石膏和锻靑礞石外,市售两个批号中成药儿童清肺丸ET01和ET02均检测到其余16种处方药材。TaqMan探针实时荧光PCR结果显示,细辛药材、中成药儿童清肺丸ET01和ET02均有典型S型扩增曲线。液质联用技术检测结果显示,中成药儿童清肺丸ET01和ET02两个批号均可检测到AAI,低于2015年版《中国药典》细辛项下AAI的限量规定10 μg/g,儿童清肺丸项下无AAI限量规定。为了消费者安全,建议《中国药典》将AAI含量作为评价儿童清肺丸的主要指标性成分之一。本研究证明二代测序技术、TaqMan探针实时荧光PCR技术和液质联用技术相结合的方法,适用于中成药儿童清肺丸的物种组成鉴定研究。2.应用二代测序技术、TaqMan探针实时荧光PCR技术和液质联用技术相结合的方法,对中成药止嗽化痰丸的物种组成进行鉴定研究。二代测序结果显示,市售两个批号中成药止嗽化痰丸ZS01和ZS02获得692和868条ITS2序列,Clean reads数分别为287177和280041;止嗽化痰丸ZS01和ZS02均检测到7种处方药材,其余处方药材未检出。TaqMan探针实时荧光PCR结果显示,马兜铃药材、中成药止嗽化痰丸ZS01和ZS02均有典型S型扩增曲线。液质联用技术检测结果显示,中成药止嗽化痰丸ZS01和ZS02两个批号均可检测到AAI,而2015年版《中国药典》未对止嗽化痰丸中AAI进行限量。为了安全考虑,建议《中国药典》对马兜铃药材及止嗽化痰丸中的AAI进行严格限量。本研究表明二代测序技术、TaqMan探针实时荧光PCR技术和液质联用技术相结合,可鉴定中成药止嗽化痰丸的部分物种组成。3.基于TaqMan探针实时荧光PCR技术进行冬虫夏草及其混伪品鉴定研究。从100份冬虫夏草及其混伪品中提取总DNA,通过Primer Premier 6.0软件设计1对特异性引物和TaqMan探针,分别在两种实时荧光PCR仪(Genesig q16和Bio-Rad CFX96)上进行灵敏度和特异性鉴定研究。灵敏度研究显示,在Bio-Rad CFX96系统中,该方法对冬虫夏草DNA模版的检测下限为0.016 ng/μL,灵敏度高于Genesig q16系统1000倍。特异性鉴定研究显示,在两种系统上该方法对冬虫夏草均有良好的特异性,能与混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草、新疆虫草明显区分。本研究表明TaqMan探针实时荧光PCR方法可准确鉴定同属变异较大的不同物种,为药材市场的管理提供技术支撑,对名贵中药材的鉴别具有较好应用前景。4.基于DNA条形码方法和TaqMan探针实时荧光PCR法对植物药材泽泻进行鉴定研究。鉴定结果显示,ITS2序列能够成功区分泽泻和东方泽泻;聚类分析结果显示,泽泻和东方泽泻各自单独聚为一支,呈现出明显的单系性,由此可见,构建NJ树法可成功鉴别泽泻和东方泽泻。TaqMan探针实时荧光PCR结果显示,所用的两对引物及探针组合对东方泽泻不具有特异性。本研究表明TaqMan探针实时荧光PCR技术鉴定同属单个变异位点的不同物种具有局限性。