鼻咽癌是我国南部地区及东南亚常见的恶性肿瘤之一,给人类健康及经济稳定造成了极大的危害。由于鼻咽癌发生部位的解剖结构较复杂,不易于手术治疗,而且对化学药物不敏感,因此,当前鼻咽癌的治疗主要依赖放射治疗。目前的临床放射治疗对早期鼻咽癌治愈效果可达90%以上,但由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分鼻咽癌患者被确诊时都接近中、晚期,错过了放射治疗的最佳时机,导致了患者五年生存率的大大降低。因此,寻找适合鼻咽癌早期诊断的血清学诊断标志物已成为目前鼻咽癌临床与基础研究的一个重要研究方向。此外,经初次放射治疗后的鼻咽癌患者,部分容易出现复发,部分容易出现远端转移,且对放射治疗不再敏感,此类复发或转移患者的预后生存率极低,因此,寻找适合易复发或易转移鼻咽癌患者个性化诊断的血清学标志物并探索适合鼻咽癌治疗的生物治疗靶标也日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。为此,本研究针对鼻咽癌的早期诊断、个性化诊断以及治疗性抗体药物研发等三部分进行有意义的前期探索。本论文的第一部分旨在寻找高特异性的鼻咽癌诊断标志物,建立鼻咽癌的血清学早期诊断方法及组织学特异性检测工具。鼻咽癌的发生及发展过程与EB病毒的感染密切相关,EB病毒相关标志物已被用于开发鼻咽癌临床诊断试剂,如EBNA1/IgA、VCA/IgA等,此类标志物对鼻咽癌的早期筛查有很好的检测灵敏度,但特异性尚达不到临床检测的要求。鉴于EB病毒主要以II型潜伏态的形式存在于鼻咽癌细胞中,本研究拟以EB病毒II型潜伏态特异性表达蛋白LMP1、LMP2A及BARF1为研究对象,探索此类标志物应用于鼻咽癌早期筛查的可能性。首先,利用原核表达的方式制备了 LMP1、LMP2A不同亲水区基因及BARF1全长基因的重组蛋白,并分别用于检测鼻咽癌患者及健康人血清中针对上述三种抗原的IgA及IgG抗体水平,结果发现,仅鼻咽癌患者血清中抗LMP1第3个胞外区(LMP1-EX3)的IgA抗体和抗LMP2A第5个胞外区(LMP2A-EX5)的IgA抗体水平显著高于健康人,提示LMP1-EX3/IgA和LMP2A-EX5/IgA有望成为鼻咽癌特异诊断的标志物;其次,利用LMP1羧基端重组蛋白(rLMP1-C.ter,aa187-aa386)及LMP2A氨基端重组蛋白(rLMP2A-N.ter,aal-aa119)免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-C.ter单抗25株和抗LMP2A-N.ter单抗16株,Western blot及免疫荧光的鉴定结果显示,抗LMP1-C.ter单抗14B6和5H8对过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-N.ter单抗13A12和12A 2对过表达LMP2A的293T细胞有反应,提示这些单抗能识别天然构象的EB病毒表达抗原,有望成为鼻咽癌检测的研究工具;最后,选取抗LMP1-C.ter单抗代表株14B6和抗LMP2A-N.ter单抗代表株13A12,分别测试它们在免疫组化实验中对临床鼻咽癌患者组织切片的检测效果,结果显示,上述两个单抗对鼻咽癌组织切片有良好的免疫组化活性和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断工具。综上,本研究发现EB病毒的潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A是两个重要的鼻咽癌特异性诊断标志物,其一是证明LMP1-EX3/IgA及LMP2A-EX5/IgA可用于建立适合鼻咽癌血清学特异筛查的免疫诊断试剂,其二是证明LMPI单抗14B6及LMP2A单抗13A12可用于建立适合鼻咽癌组织学特异诊断的免疫组化检测试剂,这些发现为研究EB病毒潜伏期膜蛋白在鼻咽癌发生发展中的作用机制和临床诊断意义奠定良好的工作基础。本研究的第二部分旨在寻找适合鼻咽癌个性化诊断的标志物,探索研制易复发或易转移性鼻咽癌的早期诊断试剂的可能性。尽管当前放射治疗对原发性鼻咽癌已取得很好的治疗效果,但仍有15-58%的患者预后容易复发或转移,并产生放疗抗性,此类病人的再次治疗的预后很差,成为鼻咽癌临床治疗中的一个难点。因此,研究适合复发性鼻咽癌早期诊断用的诊断标志物,有助于高度个性化治疗方案的制定,对提高复发性鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。文献报道EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物与鼻咽癌的发生发展密切相关,可能与鼻咽癌预后发展有关。为此,本研究拟以EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物A73为研究对象,探索其作为鼻咽癌个性化诊断标志物的可能性。首先,利用原核表达方式制备了高纯度的A73重组蛋白rGST-A73-NP9,并用于检测鼻咽癌患者血清中抗A73的IgA及IgG抗体水平,结果发现,A73/IgA的检测值可以将鼻咽癌患者分成两类,提示A73/IgA是一个不同类型鼻咽癌的分类诊断靶标;其次,利用rGST-A73-NP9免疫BALB/c小鼠,制备了抗A73的特异性单抗18株,并采用Western blot及免疫荧光方法证明A73单抗6A2对过表达A73的293T细胞有良好反应,提示A73单抗能识别自然状态下的A73抗原,为利用A73单抗研究A73表达产物提供了有用的研究工具;然后,利用单抗6A2分别对EB病毒感染的淋巴细胞系B95-8及上皮细胞系C666-1进行了 Western blot及免疫荧光的检测,结果显示,在这两种传代细胞系中均未检测到A73蛋白的表达,但在部分鼻咽癌组织中检测到A73蛋白的存在,提示A73蛋白有可能作为一个鼻咽癌分类诊断用的免疫组化检测靶标;最后,通过分离鼻咽癌细胞系C666-1细胞培养上清及鼻咽癌患者血清中的外泌体,用RT-PCR检测方法首次在外泌体中发现了 A73 mRNA的存在,提示鼻咽癌细胞中高表达的A73 mRNA很可能通过外泌体的方式转运至胞外,而此种转运方式和鼻咽癌患者血清中A73 mRNA的水平可能与鼻咽癌的复发和转移有关。综上,可能存在A73高表达和低表达两种鼻咽癌类型,而此两种鼻咽癌的转归结果是否存在差异还需要进一步鉴定。本研究的第三部分是研究LMP1和LMP2A抗体治疗鼻咽癌的效果探索LMP1及LMP2A作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。抗体药物由于具有毒副作用小及特异性强等特性,在肿瘤的治疗上表现出了明显的优势。LMP1及LMP2A是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的膜蛋白,具有很强的肿瘤组织表达特异性,而且在肿瘤的发生及发展过程中起重要作用,本研究拟通过实验证明其作为鼻咽癌抗体治疗靶标的潜在可能性。首先,基于鼻咽癌细胞系CNE-2Z构建了同时表达虫荧光素酶的LMP1及LMP2A稳定表达细胞株CNE-2Z-Luc-LMP1及CNE-2Z-Luc-LMP2A;其次,通过以白喉毒素为载体的展示肽免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-EX3特异性单抗25株及抗LMP2A-EX5特异性单抗6株,并用Western blot及免疫荧光检测方法证明抗LMPI-EX3单抗14H5和12AI与过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-EX5单抗5E9和7H3与过表达LMP2A的293T细胞有反应,在此基础上鉴定出LMP2A-EX5单抗所识别的线性B细胞表位382SLSSTEFIP390;最后,用肿瘤细胞体外生长抑制实验评估了抗LMP1-EX3单抗及抗LMP2A-EX5单抗对鼻咽癌细胞系CNE-2Z-Luc-LMPI及CNE-2Z-Luc-LMP2A的生长抑制效果,结果显示抗LMP1-EX3单抗2B8、5D4及7G9,抗LMP2A单抗5E9及7H3在体外对鼻咽癌细胞系有很好的生长抑制活性,从而初步证明LMP1-EX3及LMP2A-EX5作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。总之,本论文针对EB病毒II型潜伏态的基因转录产物进行鼻咽癌诊断靶标及治疗靶标的的探索研究,发现LMP1-EX3及LMP2A-EX5是很好的鼻咽癌诊断及治疗靶标,还发现A73是一个潜在的鼻咽癌个性化诊断靶标,为研制鼻咽癌特异性早期诊断试剂和鼻咽癌治疗性抗体药物奠定了基础。