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背景和目的:严重的高胆红素血症可以诱发新生儿急性胆红素脑病,导致神经功能障碍,但其基本机制尚未完全阐明。本研究基于iTRAQ定量蛋白质组学方法探讨脑脊液微囊泡/外泌体(MV/E)的神经蛋白质组学特点,为新生儿胆红素脑损伤发病机制的进一步阐明及疾病防治提供新的切入点。材料和方法:1、选取2017年1月1日至2020年1月1日入住郴州市第一人民医院新生儿科,发生严重的高胆红素血症且诊断为急性胆红素脑病的足月儿为研究对象。2、通过腰穿获取脑脊液,离心及试剂沉淀法分离微囊泡/外泌体,分别采用NanosightNS300、电子显微镜及Western blotting表征及验证囊泡/外泌体物理特征、形态及分子标志物。3、提取、还原、烷基化及酶解囊泡/外泌体蛋白,采用iTRAQ肽段标记、高pH UPLC肽段分离,液相色谱串联质谱鉴定差异蛋白。4、对差异蛋白进行表达聚类分析、GO及KEGG Pathway、蛋白互作网络生物信息学分析。5、选择四个差异蛋白(S100A9、S100A7、DEFA1、LTF)行 Western blotting,初步验证定量蛋白质组学结果。6、应用 IBM SPSS 20.0 软件,采用 One-way ANOVA 和 Bonferroni’s post hoc test进行统计学分析。结果:1、细胞外囊泡/外泌体粒径分布在70-200nm之间,峰浓度位于103nm处,各组间平均粒径及浓度差异无统计学意义。2、电子显微镜下可见大小不一的囊泡样结构,Western blotting示样本中有CD9,CD63囊泡/外泌体分子标志物的表达。3、细胞外囊泡/外泌体共鉴定MS/MS谱182,834个,匹配肽段5,913个,总蛋白634个,差异蛋白291个。4、差异蛋白表达聚类分析显示各组间蛋白表达模式各异。5、差异蛋白GO注释和功能富集主要分布在“extracellular region”、“extracellular regionpart”、“membrane”细胞组分中,主要参与“immune system process”、“metabolic process”、“response to stimulus”生物过程及行使“structural molecule activity”、“antioxidant activity”、“molecular function regulator”分子功能。6、差异蛋白 KEGG Pathway 主要富集在“Ras signaling pathway”、“PI3K-AKT signaling pathway”、“MAPK signaling pathway”、“Cytokine-cytokine receptor interaction”、“Rap 1 signaling pathway”等信号通路。7、差异蛋白互作网络分析显示:SAA1、APP、C4B、C5、DEFA1、LTF、CRP、S100A7、S100A9和LBP等差异蛋白之间相互关联,且与免疫炎症过程有关。8、急性胆红素脑病组与对照组相比,LTF、DEFA1表达水平显著上调,而S100A7、S100A9表达水平显著下调,这些结果与质谱鉴定结果一致。结论:1、新生儿急性胆红素脑病脑脊液中可成功提取细胞外囊泡/外泌体,且这些微囊泡存在差异蛋白的表达。2、细胞外囊泡/外泌体差异蛋白生物信息学分析表明胆红素脑损伤可能与免疫炎症过程有关。3、细胞外囊泡/外泌体及携带的差异蛋白在新生儿胆红素脑损伤的早期诊断及治疗靶标应用上具有潜在价值。