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食源性疾病是食品安全的主要问题,时刻威胁着人们的健康和生命。在食源性疾病中,细菌性食物中毒居首位。近年来,阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等病原菌引起的奶粉中毒事件时有发生。因此,食源性病原菌的检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。目前,对食品中病原菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法、免疫学方法和分子生物学方法。其中,传统检测方法操作繁琐,检测时间较长,灵敏度较低;免疫学方法的特异性和灵敏度不是很理想;分子生物学方法特异性较强、检测时间较短、灵敏度较高。三重PCR是一种在同一反应体系中加入三对特异性引物,同时扩增出三条目的DNA片段的扩增方法。本文根据阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因ompA、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、蜡样芽胞杆菌的溶血素基因hblA设计了3对特异性引物,进行三重PCR反应,可实现对阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种食源性病原菌的同时检测。对15株菌进行检测,结果4株阪崎肠杆菌、2株金黄色葡萄球菌、1株蜡样芽胞杆菌均扩增出了特异性的目的条带,而另外的8株其它病原菌均无扩增条带。将阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌的扩增产物测序序列在GeneBank上进行BLAST比对,同源性均达到99%以上。试验过程中通过对退火温度、3对引物、Mg2+、dNTPs、EasyTaq DNA Polymerase等参数的优化,确定了三重PCR的反应体系和反应程序,其反应体系为:10×Easy Taq Buffer(-Mg2+)2.5μL,2.5 mM dNTPs 2.5μL,50 mM MgSO4 1.5μL,10μM ompA上下游引物各0.6μL、10μM nuc上下游引物各1.0μL、10μM hblA上下游引物各1.0μL,模板DNA各2μL,5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.3μL,ddH2O补足25μL;反应程序为:95℃预变性5 min;按照94℃45 s,61℃45 s,72℃45 s进行30个循环;最后72℃延伸10 min。将阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌随机组合,均能扩增出特异性的目的条带。在最佳试验条件下,该三重PCR方法同时检测阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌纯培养的灵敏度是103 CFU/mL。采用无水乙醇、氨水、石油醚与试剂盒相结合的方法提取DNA,该三重PCR方法同时检测阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌在婴幼儿奶粉中的检出限是104 CFU/g。对实际样品进行检测,并将三重PCR方法与国标方法进行比较,三重PCR方法对阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌的敏感性均为100%;特异性分别为96.4%、96.6%、100%;符合率分别为96.7%、96.7%、100%。本研究以婴幼儿奶粉中出现过的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌为对象,建立了检测这三种病原菌的三重PCR方法,为同时检测食品中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌提供了新方法。