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肿瘤具有无限增殖和规避凋亡的特征。肿瘤的增殖涉及肿瘤的代谢及肿瘤免疫等多方面。肿瘤糖代谢异常能够满足肿瘤生长所需能量及提供肿瘤细胞增殖所需要的原材料外,还能造成酸性的微环境。酸性的肿瘤微环境能够抑制效应T细胞的响应、单核细胞迁移及改变细胞因子的分泌。另外,胰腺导管腺癌是典型的乏血供肿瘤,其往往处于缺氧微环境中。而HIF-1α是肿瘤重要的缺氧调控因子,其能够调控包括糖酵解在内的与肿瘤生长相关的多条通路。低氧还可以诱导非特异性CD4+T细胞分化为调节性T细胞或T辅助细胞,并且HIF-1cα还可以调控转录因子FOXP3、调节T细胞免疫检查点等。因此,HIF-1α能够通过调控有氧糖酵解及机体免疫,有利于肿瘤的增殖。同时,恶性肿瘤还具有规避凋亡的能力。HIF-1α能够通过调控Bcl-2、Bax等蛋白,促进肿瘤细胞的凋亡。在细胞凋亡中,线粒体凋亡途径处于中心环节。线粒体凋亡又与线粒体形态密切相关,尤其是线粒体分裂是线粒体凋亡的起始环节。因此,本课题从糖酵解及免疫抑制角度,研究了 HIF-1α对胰腺导管腺癌增殖的调控机制;从线粒体凋亡途径,研究了 HIF-1α对胰腺导管腺癌凋亡的调控机制。综上所述,本研究主要分为以下四部分:第一部分目的:1、分析胰腺导管腺癌组织中HIF-1α、p-Akt、p-mTOR的表达情况;2、分析组织标本中mTOR与HIF-1α表达的相关性;3、分析PANC-1细胞中mTOR对HIF-1α的调控作用。方法:1、根据胰腺癌分化程度的不同,将50例胰腺导管腺癌患者分为高-中分化和低分化两组,对胰腺导管腺癌组织标本进行免疫组化染色;2、利用西罗莫司、LY294002抑制剂和CoCl2,对PANC-1细胞进行干预,PCR分析HIF-1α、mTOR的表达情况。结果:1、胰腺癌组织中HIF-1α、p-Akt和p-mTOR高表达,并且分化程度越低,其表达量越高;2、在胰腺癌组织标本中,HIF-1α的表达情况与mTOR呈正相关,R=0.26,P=0.01;3、CoCl2能够诱导PANC-1细胞高表达HIF-1α,与未进行干预组相比差异性显著,P<0.05;4、西罗莫司和LY294002能够下调PANC-1细胞mTOR的表达;5、在PANC-1细胞中mTOR下调后,HIF-1α的表达受到抑制,与对照组相比,具有明显的统计学差异,P<0.05。结论:HIF-1α的表达与胰腺导管腺癌分化程度有关,mTOR能够调控HIF-1α的表达。第二部分目的:1、分析糖酵解通路中GLUT-1和LDHA在胰腺导管腺癌中的表达情况;2、研究HIF-1α对GLUT-1和LDHA的调控作用。方法:1、对胰腺导管腺癌组织标本进行免疫组化染色,并与HIF-1α进行相关性分析;2、PCR分析HIF-1α对GLUT-1和LDHA表达的影响。结果:(1)GLUT-1和LDHA在胰腺导管腺癌中高表达,并且与分化程度呈正相关;(2)HIF-1α与GLUT-1和LDHA表达呈正相关,相关系数分别为0.31(P=0.003)、0.37(P=0.001);(3)PCR 分析表明,当 CoCl2 诱导 HIF-1α 高表达时,GLUT-1和LDHA的表达也增高,当HIF-1α被抑制后,GLUT-1和LDHA的表达也出现显著的降低。结论:糖酵解通路中的关键酶GLUT-1和LDHA在胰腺导管腺癌高表达;HIF-1α能够调控GLUT-1和LDHA,从而利于胰腺癌的增殖。第三部分目的:1、分析胰腺导管腺癌组织中免疫抑制分子FoxP3和PD-L1的表达情况;2、研究HIF-1α对肿瘤组织FoxP3的调控作用;3、分析胰腺导管腺癌患者外周血FoxP3+T细胞、中性粒细胞的差异性;4、探究HIF-1α对FoxP3+T细胞的调控作用。方法:1、对胰腺导管腺癌组织标本进行免疫组化染色;2、PCR分析HIF-1α对FoxP3表达的影响;3、流式细胞术分析胰腺导管腺癌患者外周血FoxP3+T细胞和中性粒细胞的差异性;4、磁珠筛选CD4+T细胞和CD8+T细胞,与PANC-1进行细胞共培养;MTS检测细胞增殖情况。结果:(1)FoxP3和PD-L1在胰腺导管腺癌中高表达,并且与分化程度呈正相关;(2)PCR结果分析:HIF-1α的表达情况与FoxP3表达情况与免疫组化结果不一致;(3)流式细胞术结果分析:与高分化组对比,低分化组的FoxP3+T细胞比例较高,P<0.05;CD62LCD274+中性粒细胞比例较高,并且NLR值较大,P<0.05;(4)MTS结果显示:当抑制HIF-1α表达后,FoxP3+T细胞对肿瘤增殖的抑制作用被阻滞。结论:胰腺导管腺癌中表达免疫抑制分子;FoxP3+T细胞能够促进胰腺癌的增殖;HIF-1α可以正向调节FoxP3+T的功能,促进胰腺癌的增殖第四部分目的:1、分析HIF-1α对PANC-1凋亡的调控作用;2、研究HIF-1α对线粒体凋亡的调控机制;3、研究线粒体分裂与线粒体凋亡的关系。方法:1、siRNA干扰技术沉默HIF-1α,电镜观察PA:NC-1细胞的线粒体形态;2、化学瞬转方法分别过表达和抑制miR-125a,用CCK-8分析PANC-1的细胞活力,TUNEL分析PANC-1细胞的凋亡情况,WesternBlot分析凋亡蛋白表达情况;3、免疫荧光观察miR-125a被干扰后的线粒体形态,并且WestemBlot分析与线粒体分裂相关蛋白的表达情况结果:(1)HIF-1α被沉默后,线粒体出现“碎片化”样异常形态;(2)HIF-1α可以负向调控miR-125a的表达;(3)CCK-8实验表明,miR-125a能够抑制PANC-1细胞活力,TUNEL实验表明,miR-125a能够促进线粒体凋亡,WesternBlot结果显示,miR-125过表达后,促凋亡蛋白Caspase-9,Bax,Bad表达情况升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2,x-IAP表达情况降低;(4)过表达miR-125a后,免疫荧光染色后显示,线粒体呈“碎片化”样异常状态,并且线粒体分裂相关蛋白出现表达异常。结论:miR-125a能够通过调控线粒体分裂促进线粒体凋亡;HIF-1α能够负向调控miR-125a,从而抑制PANC-1的细胞凋亡。