【摘 要】
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抗缪勒管激素（Anti-Müllerian hormone,AMH）及其II型受体（AMHR2）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员,关于amh在哺乳动物和鱼类中的研究具有较多的报道,其在雄性和雌性性腺中表现出明显的二态性表达,但关于amhr2在包括牙鲆（Paralichthys olivaceus）在内的鱼类中则报道很少。本研究通过分子克隆和生物信息学手段克隆鉴定了牙鲆amhr2,采用半定
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抗缪勒管激素（Anti-Müllerian hormone,AMH）及其II型受体（AMHR2）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员,关于amh在哺乳动物和鱼类中的研究具有较多的报道,其在雄性和雌性性腺中表现出明显的二态性表达,但关于amhr2在包括牙鲆（Paralichthys olivaceus）在内的鱼类中则报道很少。本研究通过分子克隆和生物信息学手段克隆鉴定了牙鲆amhr2,采用半定量（RT-PCR）和相对荧光定量（RT-q PCR）技术测定了amhr2在牙鲆不同组织中的表达谱,并利用化学原位杂交方法分析了amhr2和amh m RNA在牙鲆精卵巢中的表达定位。通过本实验室前期构建的牙鲆性腺mi RNA文库,利用在线靶基因预测软件筛选出与amh和amhr2都有潜在靶向关系的mi RNAs（let-7e、let-7f和let-7g）,利用双荧光素酶和绿色荧光蛋白报告基因实验在293T细胞中进行靶向关系验证,并通过将预测靶位点定点突变对其作用关系进一步鉴定。此后,利用原代细胞培养方法,分别将精卵巢细胞分离培养,稳定传代数次后分别将amhr2过表达质粒、si-amhr2和验证有明显靶向关系的mi RNAs（let-7e和let-7f）转染至各细胞中,荧光定量检测amh、amhr2、gsdf和foxl2的表达变化。本研究主要结果如下:1、在牙鲆中通过PCR克隆得到长1,536 bp的amhr2 c DNA序列,编码511个氨基酸（aa）;在线生物信息学分析该基因包括亚细胞定位、系统进化等信息,显示amhr2较为保守,牙鲆Amhr2是一种中性不稳定的疏水性的跨膜受体蛋白。2、定量结果显示amhr2在牙鲆性腺中特异性表达,且其在卵巢中的表达水平高于精巢。化学原位杂交显示amh和amhr2在牙鲆精卵巢中的表达模式类似,在卵巢中,二者主要在Ⅱ-Ⅴ的卵母细胞中表达,在卵泡膜和间质细胞中也有较强表达;在精巢中,它们不仅在初级精母细胞还在次级精母细胞中大量被检测到,除此之外还在体细胞中大量表达。以上说明amh和amhr2广泛表达于牙鲆精巢和卵巢的生殖细胞和支持细胞与颗粒细胞等性腺体细胞中,表明二者在牙鲆配子发生和分化中扮演着重要角色。3、双荧光素酶和绿色荧光蛋白报告基因实验共同证实了,牙鲆amh和amhr2是let-7e和let-7f共同的靶基因,定点突变预测的mi RNAs靶位点后重复以上实验,充分证明amh与let-7e、let-7f存在靶向关系,amhr2与let-7e、let-7f和let-7g存在靶向关系,即let-7家族中let-7和let-7f可以负向调控amh,而let-7e、let-7f和let-7g可以负向调控amhr2。4、分别通过胰酶消化法和组织块迁移法成功培养并将牙鲆雌雄性腺体细胞与生殖细胞分离,待稳定传代后将amhr2过表达质粒、si-amhr2和第三章中鉴定的两个let-7家族中的mi RNA（let-7e、let-7f）mimics分别转染进各细胞,定量结果显示amhr2过表达质粒成功转染,随着amhr2的过表达,amh和gsdf在各细胞中的表达水平显著上升,而foxl2的表达水平则降低。转染si-amhr2和mi RNAs mimics后,各基因的表达变化相似,amh、amhr2和gsdf的表达显著下调,而foxl2的表达则上调。由此推断,在性腺的各原代细胞水平,同为TGF-β超家族的成员,amhr2可以正向调控amh和gsdf;有研究认为amhr2或是gsdf的二型受体,因此在本实验各处理组中与amh的表达量变化一致;而雌性性别相关基因foxl2则表现出相反的表达模式。这些结果说明作为AMH受体的amhr2在牙鲆性腺发育中扮演着重要角色,其在性腺发育与配子形成过程的作用机制有待更进一步的研究。
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