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目的:流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)为寄生于人鼻咽部及上呼吸道的革兰阴性小杆菌,是婴幼儿脑膜炎、肺炎和急性中耳炎等感染性疾病的主要病原体。根据是否有荚膜,流感嗜血杆菌可分为荚膜型和无荚膜型。荚膜型流感嗜血杆菌可用荚膜抗体分为6个血清型,称为可分型流感嗜血杆菌(typeable H.influenzae,THi)。无荚膜型流感嗜血杆菌无法用荚膜多糖抗体分型,称为不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable H.influenzae,NTHi)。接种流感嗜血杆菌荚膜多糖疫苗可有效保护机体免受THi感染,但对无荚膜NTHi无免疫保护作用。更为重要的是,由于荚膜多糖疫苗的免疫选择作用,近年来NTHi逐渐替代THi成为临床优势流行的流感嗜血杆菌菌型,不仅感染率逐年增高,且耐药率均不断增加。接种疫苗是预防和控制NTHi菌株流行并降低其感染率的重要措施,但迄今国内外尚无NTHi疫苗产品。有文献报道,Hap黏附素不仅是NTHi和THi均可表达、位于外膜的黏附因子,同时还可诱导机体产生具有免疫保护作用的黏膜S-IgA和血清IgG。抗原表位(epitope)是抗原分子中决定免疫原性短肽片段,基于抗原表位肽的多抗原肽(multiple antigenic peptides,MAP)疫苗是当前新型基因工程疫苗研究主要方向之一。了解NTHi临床菌株中Hap黏附素编码基因(hap)分布及其序列保守性、筛选并鉴定Hap黏附素优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性,可为研发NTHi的MAP疫苗奠定基础。实验方法:采用生物信息学软件分析NTHi菌株hap基因序列保守性并预测其T-B联合抗原表位。采用PCR扩增NTHi临床菌株hap基因5’端156 bp和3’端855 bp片段(hap-5’-156和hap-3’-855)后测序。构建Hap黏附素N端52 aa和C端285 aa片段(Hap-N52和Hap-C285)7个T-B联合抗原表位肽噬菌体展示系统。采用Western Blot和ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ)展示的T-B联合抗原表位肽抗原性和免疫反应性。结果:Hap基因产物为NTHi膜表面蛋白。不同NTHi菌株hap基因5’端156pb和3’端855 bp序列相对保守,中间区变异较大。56株NTHi临床菌株均能检出hap-5’-156和hap-3’-855片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性为92.3%～100%。Hap-N52片段中 Hap-N5-24 以及 Hap-C285 片段中 Hap-C4-27、Hap-C114-129、Hap-C150-173、Hap-C200-227和Hap-C241-267为评分较高且变异较小的预测T-B联合抗原表位。Western Blot 和 ELISA 检测结果显示,rPIII 展示的 Hap-C4-27 或 Hap-C150-173 表位肽能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9%(63/65)和92.3%(60/65)NTHi感染患儿血清标本中Hap-C4-27或Hap-C150-173表位肽IgG抗体阳性。结论:hap基因在NTHi临床菌株中分布广泛且5’端156 bp和3’端855 bp序列保守。Hap-C4-27和Hap-C150-173为Hap优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位。