2013年2-3月,新型甲型禽流感H7N9病毒在我国上海和安徽两地率先发现,H7N9禽流感是由禽H7N9亚型引起的急性呼吸道传染病。患者一般表现为流感样症状,如发热,咳嗽,少痰,可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速,表现为重症肺炎,体温大多持续在39℃以上,出现呼吸困难,可伴有咯血痰；H7N9感染的大部分病例都是恶性的,而且迅速发展为重症肺炎和急性呼吸窘迫症(ARDS)而致死。目前H7N9病毒感染的实验室检查包括血常规、血生化、病原学及相关检测及胸部影像学检查等,病原学检测是H7N9病毒筛查、确认至关重要的环节。病毒培养是诊断病原学检测的“金标准”,但与PCR比较,敏感性及特异性较低,本研究通过对甲型禽流感和H7N9亚型保守区基因序列进行分析,分别设计高度特异性的引物与Taqman探针,建立了四重荧光定量RT-PCR,采用一步法可同时检测M基因、H7基因、N9基因以及内参RP基因。本研究分两部分：第一,四重荧光定量RT-PCR法检测H7N9病毒方法的建立；第二,该方法的对临床标本检测的实际应用。第一部分 四重荧光定量RT-PCR检测新型甲型禽流感病毒H7N9方-法学的建立方法：1.从美国NCBI基因库下载涵盖国内外F1uA及甲型流感病毒H7N9亚型的多条基因序列,用DNAman软件对其进行同源性比较,确定以上病毒基因组的保守区,用Primer Express3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与TaqMan探针,并进行BLAST序列比对验证引物特异性。并对RT-PCR反应体系中,四套引物及探针的浓度进行优化。2.合成各基因标准品片段,将其连接到质粒载体PmdTM19-T Simple Vector上进行转化和培养。经鉴定后提取质粒DNA,利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度,确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。根据实验需要,将标准品定量母液稀释至所需最高浓度(107copies/mL),并连续10倍稀释至最低浓度(102copies/mL),平行进行荧光定量RT-PCR反应,验证其灵敏度,并与WHO推荐的方法进行比对。3.在本方法的反应体系中加入其它21种呼吸道病原微生物[季节性H1N1、H3N2、新甲型H1N1 (2009)病毒,乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒A和B型,麻疹病毒,肠道病毒EV71、肠道病毒CoxA16,肺炎支原体,肺炎克雷伯菌,鲍曼不动杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,白念珠菌,禽流感H5N1、H5N3、H9N2病毒,人副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型]提取的模板,比较反应体系的特异性。4.将确定好的各质粒DNA浓度,根据实验需要,稀释至所需要的浓度(106copies/mL),连续三次10倍稀释至(104copies/mL),用本方法分别检测5次,得到的CT值计算其标准差和变异系数,检测反应体系的重复性。结果：1.四重荧光定量RT-PCR反应体系的灵敏度：本方法在检测甲型禽流感病毒基质蛋白(M)区、H7、N9及RNaseP的合成片段时,各自灵敏度与WHO推荐的方法一致,均在102copies/mL时能扩增出条带。3.四重荧光定量RT-PCR反应体系的特异性：将上述21种呼吸道病原菌的RNA提取物作为模板分别加入多重荧光定量RT-PCR进行测定,除流感病毒出现很好的阳性结果外,其它所有病毒的检测结果均呈阴性。4.四重荧光定量RT-PCR反应体系的重复性：不同浓度核酸各自的检测Ct值标准差在0.11～0.37之间,变异系数(CV均低于1.62%,具有较好的重复性。结论：所建立的四重荧光定量RT-PCR法可检测甲型流感病毒,并区分H7N9亚型,其检测快速、准确,具有临床推广价值。第二部分 四重荧光定量RT-PCR法检测H7N9病毒方法的临床应用方法：1.利用所建立的四重荧光定量RT-PCR方法对1896例疑似患者的痰液标本进行检测,对结果进行统计分析,并与上海之江生物有限公司生产的市售试剂盒的方法结果比较。2.连续20天收集35例H7N9确诊病例的咽拭子标本和痰液标本,用本方法进行检测,探讨标本对结果的影响。结果：1.对临床1896例疑似患者的痰液标本应用本方法进行检测,共筛查出甲型流感病毒235份,其中127份为甲型流感病毒H7N9感染,与之江生物有限公司的市售试剂盒检测结果的符合度达100%。2.痰液标本的阳性率明显大于咽拭子标本,(26.57%vs8.86%,x2=75.34,p<0.001),且在痰液标本中检测到H7N9病毒的时间明显长于咽拭子标本(平均6.14天vs 2.42天)。结论：本方法建立的实时荧光定量PCR技术简便快捷、重复性好,对临床上疑似甲型流感病毒感染的患者可提供早期明确诊断,并可区分高致病性H7N9亚型,为临床治疗方案的制定提供参考依据,并且本方法从疑似患者的咽拭子、痰液标本中都可以检测到病毒,但痰液标本的检测结果更加稳定、可靠。