铁是几乎所有活体中的一种必需元素。在细胞呼吸链电子传递、能量代谢、血红素代谢、氧的运输、细胞信息传递、DNA合成、免疫功能等方面发挥重要作用。大量研究表明,铁缺乏或铁过量都会对机体产生不利影响,因此维持机体铁稳态尤为重要,机体缺乏有效的铁“排泄机制”,机体铁稳态的维持主要通过肠道铁吸收的精细调控实现。目前对铁吸收的研究机制发现,小肠中有两种主要铁转运体即二价金属离子转运体DMT1和ferroportin1(FPN1)在铁吸收调节方面发挥重要作用。DMT1是一种跨膜蛋白,转运二价铁离子跨越小肠上皮细胞的顶端进入肠细胞,FPN1是位于基底膜上的铁转出蛋白,将铁离子转运进入血液循环。为保证机体的铁平衡,机体需要在铁吸收、利用和储存之间进行协调,在最近几年的研究中发现,Hepcidin(由HAMP基因编码)是铁稳态的一个主要调节因子。Hepcidin是肝细胞分泌的一种循环肽,并通过结合细胞表面的ferroportin而导致ferroportin的内化和降解从而导致铁释放减少。心理应激(psychological stress)是机体通过认识、评价而察觉到应激源的威胁时引起的心理、生理技能改变的过程,是个体对面临的威胁或挑战作出适应和应付的过程。随着社会的发展及各方面竞争压力的增加,来源于社会的精神心理因素的应激对人类健康的影响越来越强烈,并成为重要的应激源。许多研究证实,在心血管疾病、内分泌疾病、神经精神疾病和自身免疫性疾病的发生中心理应激起了重要作用。军人作为一个特殊群体,经常要面对突发性事件,如战争爆发,反恐怖袭击执行特种任务等等,这些特殊情况和特种作业条件都容易诱发军人心理应激反应。前期研究发现,心理应激可引起机体铁代谢紊乱,造成血清铁明显下降、肝细胞铁明显增加。一方面,铁缺乏而引起的最大氧摄入和肌细胞的氧化代谢能力降低,而另一方面,铁过量又会导致大量自由基的产生,故心理应激引起机体铁稳态破坏可影响指战员的健康,进而影响部队作战能力。因此,阐明心理应激血清铁下降和肝脏铁蓄积的发生机制,以及预防和治疗措施,无疑将对防治军人应激损伤产生有积极的意义。因此,我们进行了如下研究:目的了解心理应激对小肠铁吸收的影响及其机制探讨,为阐明心理应激与血清铁下降的关系以及深入探讨军事应激对机体因铁稳态改变而引起的作战能力的下降提供实验基础,并为防治心理应激导致的低铁血症提供新思路。方法一、心理应激模型的制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。Communication BoxSystem由透明丙烯酸板组成,一半小室(A室)底部铺板绝缘,另一半小室(B室)通电。在B室的实验大鼠接受30min/d,足底电击(电压90V,电流0.80mA):电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。ELISA法测定血清促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)含量,放免试剂盒测定下丘脑内去甲肾上腺素(NE)含量。二、心理应激对大鼠铁吸收的影响。(一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG)、心理应激7天组(PSG)和足底电击组(FSG),每组10只。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%;使用不锈钢代谢笼具单笼饲养,自由饮食及去离子水,饲料配方为AIN-93G,铁含量为35mg/kg饲料。自然昼夜节律变化光照。(二)大鼠心理应激模型的制作方法同前。心理应激组连续心理应激7天。(三)大鼠鼠粮摄入量测定每天更换大鼠鼠粮,使用电子天平精确称量大鼠鼠粮日摄入量。(四)大鼠粪便收集为使粪便收集齐全,在大鼠从代谢笼中移至心理应激模型中,大鼠单个塑料笼转运。为使粪便收集精确,通过卡红标记粪便(收集两次红色之间的粪便,不包括第二次红色粪便)。(四)大鼠铁表观吸收率的计算大鼠铁表观吸收率通过经典的代谢平衡法计算,即计算一定时间内的铁摄入量及排泄物铁含量而得,由于尿中铁含量甚微,可忽略不计。因此铁表观吸收率=(摄入铁含量-粪便铁含量)×100%/摄入铁含量。(五)大鼠小肠Perl’s铁染色各时间段心理应激完成后腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏冷PBS冲洗,取小肠组织4%多聚甲醛固定后石蜡切片制成5μm切片用于Perl’s铁染色。三、心理应激对大鼠小肠铁吸收机制的影响(一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG,n=30)、心理应激1天组(PSG1,n=10)、心理应激3天组(PSG3,n=10)、心理应激7天组(PSG7,n=10)和足底电击组(FSG,n=10)。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%;使用不锈钢代谢笼具单笼饲养,自由饮食及去离子水,饲料配方为AIN-93G,铁含量为35mg/kg饲料。自然昼夜节律变化光照。(二)心理应激模型制作方法同前。心理应激1天组:心理应激1天;心理应激3天组:连续心理应激3天:心理应激7天组:连续心理应激7天。(三)心理应激对肝脏IL-6含量的影响EUSA法检测心理应激1天组,3天组,7天组及对应的空白对照组肝脏IL-6含量。(四)心理应激对小肠Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝脏Hepcidin的影响Western Blot检测各实验组及空白对照组小肠粘膜铁蛋白,二价金属离子转运体含铁反应原件和非铁反应原件,膜铁转运蛋白及肝脏Hepcidin蛋白表达情况。四、心理应激IL-6干预后对小肠铁吸收机制影响的研究(一)实验动物分组于第二军医大学实验动物中心购得SD雄性大鼠40只,分为正常对照组(CG,n=10)、心理应激组(PG,n=10)和心理应激干预组(A-PG,n=10)及躯体电击组(n=10)。心理应激干预组于应激前腹腔注射100μl的PBS(含2μg的IL-6 Antibody)/只大鼠,心理应激组于应激前注射PBS 100μl/只大鼠。(二)心理应激模型制作方法同前。(三)心理应激IL-6干预后大鼠十二指肠Perl’s染色方法同前。(四)心理应激对大鼠小肠Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝脏Hepcidin的影响Western Blot检测各实验组及空白对照组小肠粘膜铁蛋白,二价金属离子转运体含铁反应原件和非铁反应原件,膜铁转运蛋白及肝脏Hepcidin蛋白表达情况五、数据统计与处理实验数据采用SPSS13.0统计软件包采用两样本t检验及单因素方差分析进行数据分析,实验数据以平均数±标准差((?)±S)表示,显著性水平为P＜0.05,非常显著性水平为P＜0.01。结果一、心理应激模型的制作(一)大鼠血清CORT、ACTH含量以及下丘脑NE含量的测定结果心理应激组大鼠血清CORT、ACTH含量与下丘脑NE含量较对照组明显升高(P＜0.05)。二、心理应激对大鼠铁吸收的影响(一)心理应激对大鼠鼠粮摄入量的影响心理应激第1天,第3天和第7天与对照组的第1天,第3天和第7天的鼠粮摄入量无明显差异(P＞0.05),表明各组大鼠铁摄入量无明显差异。(二)心理应激对大鼠粪便铁含量的影响心理应激组第1天和对照组第1天粪便铁含量无统计学差异(P＞0.05),心理应激组第3天与对照组第3天,心理应激组第7天和对照组第7天粪便铁含量相比均增加(P＜0.05)。(三)心理应激对大鼠铁表观吸收率的影响心理应激组第1天和对照组第1天铁表观吸收率无统计学差异(P＞0.05),心理应激组第3天与对照组第3天,心理应激组第7天和对照组第7天相比铁表观吸收率均下降(P＜0.05)(四)心理应激对小肠的Perl’s铁染色心理应激1天组和对照组的肠绒毛上皮细胞和隐窝处均为发现明显的蓝色含铁颗粒沉积;心理应激3天组肠绒毛上皮细胞可以看到散在的蓝色铁颗粒沉积,隐窝处未见;心理应激7天组肠绒毛上皮细胞可以看到比较明显的蓝色铁颗粒沉积,而隐窝处未见。三、心理应激对大鼠小肠铁吸收机制的影响(一)心理应激对大鼠肝脏IL-6含量的影响除心理应激1天组和对照组无统计学差异外,心理应激3天组和7天组肝脏IL-6含量均与其相应的对照组有统计学差异(P＜0.05)。(二)心理应激对大鼠小肠粘膜铁蛋白,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1表达影响。通过Western blot检测发现心理应激1天组铁蛋白表达与对照组相比无统计学差异,心理应激3天组和心理应激7天组铁蛋白表达高于与对照组。心理应激1天组、3天组和7天组DMT1(-IRE)蛋白表达与对照组相比无明显变化;心理应激1天组和3天组DMT1(+IRE)蛋白表达与对照组相比无明显变化,但7天组与对照组相比表达显著减少;心理应激1天组FPN1蛋白表达与对照组相比无明显变化,但3天和7天组表达均明显减少。(三)心理应激对大鼠肝脏Hepcidin表达影响通过Western blot检测发现心理应激1天组和对照组Hepcidin表达无明显变化,心理应激3天组和7天组与对照组相比表达显著增加。四、心理应激IL-6干预后对铁吸收调节机制的影响(一)心理应激IL-6干预后大鼠十二指肠Perl’s染色正常对照组十二指肠绒毛上皮细胞未见蓝色铁颗粒;心理应激干预后与心理应激未干预相相比十二指肠绒毛上皮细胞未见蓝色铁颗粒,而心理应激组可以明显看到蓝色铁颗粒。正常对照组、心理应激组和心理应激IL-6干预组隐窝处均未见蓝色铁颗粒。(二)心理应激IL-6干预后对大鼠肝脏Hepcidin蛋白表达影响心理应激干预后,与心理应激未干预组相比,肝脏Hepcidin表达明显减少(P＜0.05);为正常对照组相比,无明显差异(P＞0.05).(三)心理应激IL-6干预后对大鼠十二指肠DMT1(+IRE),FPN1和Ferritin蛋白表达的影响心理应激干预组,与心理应激未干预组相比,十二指肠膜铁转运蛋白FPN1、二价金属离子转运体DMT1(+IRE)表达显著上升,与正常对照组无统计学差异;心理应激干预组铁蛋白Ferritin与心理应激未干预组相比,表达明显下降,与正常对照组相比无统计学差异。结论本研究通过Communication Box成功制造了心理应激模型,观察了心理应激情况下的铁吸收变化及通过Western Blotting观察了心理应激对与铁吸收密切相关的主要因子的表达变化。主要结论如下:1、随着心理应激的时间延长,大鼠对铁的吸收减少,同时小肠粘膜铁染色发现小肠粘膜细胞有铁潴留。2、随着心理应激时间的延长,肝脏IL-6含量明显增多,且肝脏Hepcidin表达增加。进而小肠FP1表达逐渐减少,提示心理应激可能是通过IL-6的升高诱导肝脏Hepcidin的表达增加,最终影响小肠运出蛋白FP1的表达减少来抑制小肠铁吸收。3、发现小肠DMT1(+IRE)的表达变化落后于小肠FP1的变化,提示可能是小肠运出蛋白FP1表达减少后,促使肠细胞合成铁蛋白增加,进而再来影响小肠铁输入蛋白DMT1(+IRE)的表达。4、心理应激IL-6干预后,心理应激干预组肝脏Hepcidin表达相比与未干预组明显下降,同时十二指肠未见铁潴留,十二指肠膜铁转运蛋白FPN1和DMT1(+IRE)表达均增加。