龙眼(Dimocarpus longanLour.)是无患子科龙眼属常绿热带/亚热带木本果树,原产于中国华南地区和东南亚。龙眼胚胎的发育状况对其坐果率、果实产量、种子大小和果实品质等都有重要的影响。龙眼合子胚发育过程的研究存在不易观察、取材困难、遗传背景复杂等,在分子水平上对合子胚的研究局限很大。植物体胚发生与合子胚胚胎发生在大部分发育阶段高度相似,体胚发生成为研究植物胚胎发生分子调控机制的模式系统。龙眼体胚发生系统己经成为研究木本植物胚胎发生的模式系统。本研究对龙眼体胚发生早期不同发育阶段进行转录组学和蛋白质组学测序分析,以探讨龙眼体胚发生过程的分子调控机制,为龙眼胚胎发育调控奠定基础。同时,基于龙眼EC转录组数据库进行了开花时间相关基因的克隆及其表达分析,并对部分开花时间相关基因及其启动子遗传转化烟草的功能研究。此外,建立了一种龙眼快速转基因方法,为龙眼的基因功能研究与种质创新提供了新的思路。1龙眼体胚发生早期转录组学分析龙眼体胚发生早期NEC、EC、ICpEC和GE四个阶段的转录组测序共生成243,783,126高质量reads,与参考基因组的比对率介于81.11～82.08%,与参考基因的比对率49.07～57.51%,共检测到130,354个可变剪切事件。在NEC、EC、ICpEC、GE四个阶段分别获得22743、19745、21144、21102个表达基因,1935、1710、1816、1732个新转录本,以及2645、366、505、588个阶段特异表达的基因。在 NEC__s_EC、EC_vs_ICpEC、EC_v__GE、ICpEC_vs_GE 的阶段之间成对比较中分别筛选获得10642、4180、5846、1785个差异表达基因。NEC_vs_EC中4887个基因上调表达,5755个基因下调表达;EC_vs_ICpEC中2689个基因上调表达,1491个基因下调表达;EC_vs_GE中上调表达基因3451个,下调表达基因2395个;ICpEC_vs_GE中上调表达基因832个,下调表达基因953个。这些差异表达基因主要富集在代谢途径、次生代谢物合成、植物病原互作、植物激素信号转导,以及许多差异表达基因还富集在苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、脂肪酸生物合成、玉米素生物合成、色氨酸代谢等KEGG通路。通过不同发育阶段的转录组比较分析,揭示了生长素和细胞分裂素等激素信号途径在龙眼体胚发生过程的重要调控作用。类黄酮和脂肪酸生物合成相关基因的表达调控模式表明,类黄酮主要在NEC阶段积累,而脂肪酸则主要积累在体胚发育的早期阶段。此外,DNA复制、细胞周期相关基因和胞外蛋白编码基因LTP、CHI、GLP、AGP、EPl在龙眼体胚发生早期发生显著差异表达变化,与龙眼体胚发生密切相关。转录组表达调控分析结合qRT-PCR分析,鉴定了 27个龙眼 SE 分子标记基因(LEC1、LlL、PDF1.3 GH3.6、AGL80、PIN1、BBM、WOX9、FOX2、ABI3、FUS3、LEC2等)以及28个NEC阶段的分子标记基因(LEA5、CNOT3、DC2.15、PRl-1、NsLTP2、DIRl、PIPl、PIP2.l、TIP2-1、POD-P7和POD5等),所鉴定的SE与NEC分子标记基因可能在龙眼体胚发生过程中发挥重要的调节作用,这些分子标记基因可能是决定龙眼体胚发生潜能的关键因子。2基于iTRAQ标记的龙眼体胚发生早期蛋白质组学分析基于iTRAQ标记的龙眼体胚发生早期NEC、EC、ICpEC和GE四个阶段蛋白质组学共鉴定5035个蛋白质。COG直系同源分类发现,这些蛋白质主要富集在一般功能预测,翻译后修饰、蛋白质转换和分子伴侣,翻译、核糖体结构和生物起源,复制、重组和修复,转录,糖类转运与代谢,能量产生与转换,氨基酸转运与代谢,信号转导机制,脂类转运与代谢。所鉴定蛋白质KEGG通路主要富集在代谢途径与次级代谢物的合成,占41.81%,此外,核糖体、RNA转运、剪接体、植物病原互作、内质网中蛋白质加工、嘌呤代谢、激素信号转导途径等通路也是比较富集的途径。龙眼体胚发生过程4个阶段蛋白表达量的成对比较,包括 NEC_vs_EC、NEC_vs_ICpEC、NECv_vs_GE、EC_vs_ICpEC、EC_vs_GE 和ICpEC_vs_GE,分别鉴定出82、78、103、73、160和116个差异表达蛋白。蛋白质差异表达分析,揭示了体胚发生相关蛋白LECl-like、CHI5/-4、AGP和EP1等在龙眼体胚发生过程中发生差异性积累,可能参与龙眼体胚发生早期的调控过程。龙眼体胚发生早期,糖类与能量代谢过程相关蛋白发生显著差异表达,尤其是糖酵解途径、戊糖磷酸途径、酒精发酵和TCA循环等呼吸作用相关蛋白在球形球阶段几乎都显著上调,说明糖类与能量代谢在龙眼体胚发生过程中具有非常重要的调控作用。生长素、脱落酸和赤霉素等激素合成与信号转导相关蛋白,胁迫应答相关蛋白CAT、POD、APX、GPX、GST、HSP90/-60等也发生显著差异表达,说明其在龙眼体胚发生早期具有重要的调控作用。此外,脂质代谢、蛋白质代谢、细胞骨架结构相关蛋白差异表达显著,可能参与龙眼体胚发生早期的调控过程。为了深入研究龙眼体胚发生早期转录组与蛋白组之间的关系与相互影响,将这二个组学的数据进行了关联分析表明,几乎所有的鉴定(96.4-97.7%)和定量(98.3～99.5%)的蛋白质都有相关联的转录本,仅有小部分的差异表达蛋白质有相关联的转录本。差异表达蛋白质和基因的关联分析表明,表达变化趋势相同的蛋白质/基因总在所有比对中仅有147个,并且关联度都较低;而变化趋势相反、蛋白质差异表达基因无差异、蛋白质无差异表达而基因差异表达的蛋白质/基因分别有66、392和5166个,进一步说明了龙眼体胚发生转录组与蛋白质组的关联度低。因此,从转录组和蛋白质组学可以从基因表达水平及蛋白质表达水平这二方面对龙眼体胚发生过程分子调控机制进行分析是极为必要的,对构建龙眼体胚发生分子机制的研究具有重要的意义。针对龙眼体胚发生过程Remorin蛋白及其编码基因在转录水平和蛋白质水平都发生差异变化,从龙眼EC克隆了 Remorin家族的5个成员,并对其在龙眼体胚发生过程中的表达模式进行了分析,结果表明Remorin蛋白及其编码基因可能参与龙眼体胚发生过程的调控。3龙眼胚性愈伤组织(EC)中开花时间相关基因的克隆及表达分析通过对龙眼体胚发生早期转录组数据的进一步挖掘,筛选并克隆了 43条开花时间相关基因,并在龙眼体胚发生过程、合子胚发育过程、龙眼不同组织部位、不同外源激素处理、不同胁迫压力处理下对这些开花时间相关基因进行表达分析,初步揭示了这些开花时间在龙眼体胚发生和其它生长发育过程中的潜在功能。3.1龙眼EC中D/MFT与D/TFlL的克隆与表达分析为了研究龙眼DlMFT与DlTFL1基因的功能,从龙眼EC中克隆DlMFT与DlTFL1基因及其启动子。启动子分析表明,DlMFT启动子序列中含有众多的植物激素响应元件和光响应元件,还含有许多种子中特异的转录调节元件。亚细胞定位表明DlMFT定位于细胞核。qRT-PCR结果表明,DlMFT是种子特异表达基因,但是在败育的种子中却不表达,DlMFT在龙眼体胚发生和合子胚发育过程中表达量显著上升,尤其是在晚期或成熟阶段的表达量最高,在种子萌发过程中表达量持续下降。DlMFT在龙眼EC中对外源激素的响应存在差异,生长素、水杨酸和茉莉酸甲酯抑制其表达,而ABA和BR促进其表达。同时,DlMFT可以差异性的响应多种不同的非生物胁迫。因此,DlMFT可能是龙眼体胚、合子胚发育,以及种子萌发的关键调节因子,并且可能参与复杂的植物激素与胁迫响应应答过程。启动子分析表明,DlTFLl启动子序列中含有众多的植物激素响应元件和光响应元件。qRT-PCR结果表明,DlTFL1在晚期合子胚中D/TFL几乎不表达,在体胚发生早期转录水平下调,说明其可能对体胚发生早期阶段的发育有抑制作用。在龙眼营养芽、幼嫩茎、花蕾和雌花中大量表达,在其它组织部位中几乎不表达。DlTFL1在龙眼EC中对外源激素的响应存在差异,ETH、KT、SA、MeJa、PP333、GA3能促进DIlFL1的表达,而2,4-D抑制DlTFL/的表达。同时,DlTFL1可以差异性的响应多种不同的非生物胁迫。在EC中DlTFLl能响应外源激素与非生物胁迫应答,因此,DlTFL1可能参与龙眼花期调控及花器官发育调控,以及体胚发生早期调控,并且涉及复杂的激素信号与胁迫应答过程。3.2龙眼EC中光敏色素与隐花色素基因家族的克隆与表达分析从龙眼EC中克隆了光敏色素DlPhyA、D/Ph;如、DlPhyC与隐花色素DlCryl、DlCry2和DlCry3,并进行了进化分析与潜在调控miRNA的分析。定量分析结果表明,DlPhys和DlCrys在体胚发生及合子胚发育过程中表现出阶段差异表达特性,推测其可能参与龙眼胚胎发育过程。龙眼不同组织部位中定量分析显示,DlPhyA与DlPhyB主要在种子中表达,而在其它组织部位中表达量极低或几乎不表达,说明DlPhyA与DlPhyB可能参与种子的发育过程;而DlPhyC在花药、雌花、花序、叶、花蕾等组织部位中表达量较高,可能参与龙眼花器官发育过程的调控等过程;DlCry;DlCry2、DlCry3的表达模式比较相似,在叶片中的表达量都最大,在叶芽、花序、花蕾雌花和种子等组织部位也具有较高的表达量。不同光质及不同激素处理下定量分析,表明在龙眼EC中DlPys和DlCrys可能参与复杂的光信号传导及激素信号途径的调控。3.3龙眼EC中生物钟相关基因克隆与表达分析从龙眼EC中克隆了 14个生物钟相关基因DlELF4、DlELF4-like1、DlELF4-like4、DlEL1、DlELF3、DlELF6、DlZTL、DlKelch、DlLHY、DlFKF1、DlTOC1、DlGl、DlC09 和 DlCO10,并分析 了 DlELF4、DlELF4-like1、D1ELF4-like4、DlEL1、DlELF3、DlCO10和DlGJ在龙眼胚胎发育过程、不同组织部位、GA3和BR等处理下的表达分析。结果表明,D/DLF4家族可能参与调控龙眼胚胎发育过程及激素信号转导和胁迫应答,还可能参与龙眼花的形成及果实发育过程。同时,龙眼胚胎发生过程中DlEL1、DlELF3、DlCO10和DlGI的表达模式存在一定的差异,可能参与龙眼胚胎发育过程调控。DlEL1、DlEEF3、DlO10和DlGI在龙眼不同组织部位中表达模式存在差异,可能参与龙眼生长发育过程不同阶段的调节,它们在龙眼花器官中的表达量都相对较高,可能参与龙眼花器官的发育过程。此外,GA3和BR能显著提高DlEL1、DlEL1、DlCO10和DlG/的表达。3.4龙眼EC中GRAS家族6个成员克隆与表达分析从龙眼EC中克隆GRAS家族6个成员DlGRAS4、DlGRAS54、DlGFAI DlGAIP-B、DlSHR、DlRGL2。DlGRAS54属于PAT1亚家族 DlGRAS4属于SCL亚家族,与SCR亚家族亲缘关系较近;DlGAI、DlGAIP-B、DlRGL2属于DELLA亚家族,而DlSHR属于SHR亚家族。qRT-PCR结果表明,DlGRAS4在体胚发生过程转录水平呈“W”状趋势,在球形胚和子叶形胚阶段的表达量最值;DlGRAS54在整个发育阶段的转录水平呈“M”状趋势,在球形胚和鱼雷形胚阶段表达量最值,表明DlGRAS4和DlGRAS54主要在发育的中晚期起作用。外源赤霉素处理后DlGRAS4和DlGRAS54的表达量显著上调,说明DlGRAS4和DlGRAS54能积极响应外源GA3。qRT-PCR结果表明,DlGA与与DlGAlP-B在晚期合子胚发育过程中发生差异表达。在种子萌发过程中D/GAl与DlGAIP-B的表达量逐渐增加,说明其可能与种子萌发过程有关。DlGAlP-B在种子中的表达量相对较高,在其它组织部位中几乎不表达,说明DlGAIP-B可能与种子的发育相关。DlGAI在花药、花序、叶片中表达量较高,其次为雌花和种子,推测DlGAI可能参与龙眼生长发育多个过程,尤其是花器官发育过程的调控。不同激素及非生物胁迫下DGlAI与DlGAIP-B的表达模式相似,GA3和BR对D/GAI与DlGAIP-B的表达具有显著的促进作用,ABA与IAA对其表达也有一定的促进作用,但是SA与MeJa、NaC1和PEG4000处理则抑制其表达,说明D/GAI与D/GAIP-B参与激素信号途径的调控及非生物胁迫的响应。3.5龙眼EC中自主途径及其它开花相关基因克隆与表达分析从龙眼EC中克隆了 3个自主途径相关基因DlFPA1、DlFPA2和DlFLD,3个胚花基因DlEMF1、DlEMF2a、DlEMF2b,自主途径与春化途径整合因子DlFLC,以及开花抑制因子FRI家族5个成员。qRT-PCR结果表明,自主途径相关基因、胚花基因可能与龙眼胚胎发育过程有关,并且在龙眼不同组织部位中表达模式存在差异,可能参与调控龙眼生长发育。此外,GA3和BR对DlFPA1、DlFPA2、DlFLD、DlEMF1、DlEMF2a、DlEMF2b 的表达具有促进作用。4龙眼胚性愈伤组织中开花时间相关基因的功能分析4.1龙眼胚性愈伤组织中DlMFT与DlTFL/的功能分析构建龙眼DlMFT与DlTFL/启动子表达载体,利用烟草叶片GUS瞬时表达水平进行了启动子的功能验证,表明DlMFT和D/TFL1启动子可用于后续研究。构建DlMFT与GFP融合的亚细胞定位表达载体,瞬时转化于洋葱内表皮细胞,亚细胞定位显示,龙眼DlMFT主要定位于细胞核中。构建DlMFT与DlTFL1的过表达与干扰载体,采用农杆菌介导法转化本氏烟草。结果表明,异位表达DlMFT与wft不影响转基因植株的开花时间,但过表达DlMFT抑制种子的萌发,mft植株促进种子的萌发,说明龙眼DlMFT可以抑制种子的萌发但不具有调控花期的功能。DlTFL1过表达植株比对照植株的叶片较浓绿、营养生长较旺盛、侧芽增多、开花延迟;与对照相比,mft植株侧芽较少,开花提前。说明龙眼DlTFL1在调控植物开花时间上具有重要的功能。4.2龙眼胚性愈伤组织中DlSHR的功能分析构建DlSHR的过表达载体,采用农杆菌介导法转化本氏烟草。与对照植株相比,DlSHR转基因烟草的生长发育明显迟缓,开花明显延迟;根系较粗大、数量较少、根部光滑、几乎没有根毛,甚至有些根部明显膨大。茎部略微扭曲,叶片较小、扭曲或折叠,叶片表皮毛变粗大,甚至在叶肉部位都有较粗的表皮毛。通过对根部的显微观察发现,转基因植株仅有极少数的短根毛,并且在根部的皮层和内皮层细胞比对照明显增多,呈现出极密集的小细胞集合,甚至有些细胞可能已经挤破并释放出内含物质。因此,过表达DlSHR对植物的生长发育有重要的影响,尤其是对根、茎和叶的生长发育有重要影响,并且显著延迟开花。实时荧光定量PCR表明,上述表型越明显的植株,DlSHR的表达量越高,并且转基因烟草内源的NbSCR1、NbSCR2以及NbGAI的表达量也显著上调,说明DlSHR可能通过促进根辐射状基因SCR及赤霉素相关的GAI的表达,进而影响根系的结构及叶片形态等发育过程。将分离纯化后的DlSHR转基因植株按根部和地上部分分别与对照进行转录组测序分析。比较转录组学结果表明,激素信号转导途径在转基因植株中是最显著富集的代谢通路。此外,过表达DlSHR对内源SCR、DELLA、Jackdaw、EXORDIUM-like、14DK和36.4DK富含脯氨酸蛋白编码基因的转录水平具有明显的调节作用,进而调控转基因植株根辐射形态、根毛生长和叶片形态等生长发育进程。5龙眼快速转基因方法体系的建立以龙眼土播实生幼苗为受体材料,采用去顶芽和去顶法进行创伤,利用根癌农杆菌介导的转化方法侵染伤口,成功将目标基因原位转化龙眼,通过筛选获得了大量正常生长发育抗性芽。经过不同生长发育阶段多次的目标基因PCR检测表明外源基因已经整合到龙眼DNA中,qRT-PCR分析表明外源片段在龙眼植株内进行转录,说明已经建立了一种龙眼快速转基因方法,转基因植株的阳性率超过20.83%。此法不依赖植物组织培养,不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞,具有操作简便、成本低、周期短、转化效率较高、成活率高、可周年生产等优点,对龙眼的基因功能研究和种质创新具有重要的意义。