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目的: 探讨CD137信号是否通过抑制自噬小体与溶酶体融合促进动脉粥样斑块钙化的形成。 方法: 实验分别采用ApoE-/-小鼠和组织贴块法原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)为模型,30只ApoE-/-小鼠和原代VSMCs随机分三组:对照组:炎症因子混合物预刺激(TNF-α,IL-1β,INF-γ各10 ng/ml);CD137激动组:对照组+重组CD137L蛋白;CD137抑制组:对照组+抑制型CD137抗体+重组CD137L蛋白。vonKossa染色评估细胞及斑块钙化程度,免疫组织化学染色检测ApoE-/-小鼠斑块中自噬相关蛋白LC3B、Beclin1及p62的表达水平。采用Western blot检测细胞内钙化及自噬相关蛋白BMP-2、Runx2、LC3I/II及p62的表达水平,应用自噬双标腺病毒感染小鼠主动脉平滑肌细胞,标记LC3蛋白,荧光倒置显微镜下观察自噬流情况,通过透射电子电镜观察小鼠斑块内及小鼠平滑肌细胞内的自噬小体的形成。 结果: (1)重组CD137L蛋白激动CD137信号后,Western blot显示:小鼠VSMCs中自噬相关蛋白(LC3II/I比值)水平增加,并呈时间及浓度依赖性,以刺激6h和10μg/ml时细胞自噬最为明显,CD137激动组和抑制组VSMCs中LC3II/I比值较对照组均有升高(9.41±0.93 vs1.61±0.33;4.20±0.55 vs1.61±0.33,P<0.01),并且激动组高于抑制组。同样CD137激动组p62蛋白表达高于CD137抑制组(2.76±0.39 vs2.16±0.18, P<0.05)。 (2)mRFP-GFP-LC3双标腺病毒标记自噬小体,荧光显微镜结果表明,CD137激动组的总斑点数较对照组增加,黄色斑点较对照组显著增多,红色斑点极少,表明自噬增强,而自噬流不通畅;CD137抑制组的总斑点数较对照组增加,平均每个细胞红色斑点较CD137激动组多,而黄色斑点相比于刺激组少,表明自噬流通畅。 (3)流式细胞术观察细胞自噬水平显示:CD137激动组 VSMCs自噬水平为(77.3±6.4%),CD137抑制组为(72.5±7.1%),对照组为(63.0±5.1%),CD137激动组和抑制组自噬水平均高于对照组(P<0.05),CD137激动组最高。 (4)透射电镜结果显示:CD137激动组小鼠斑块中自噬小体的数量较多,CD137 抑制组自噬小体较激动组较少。与斑块中观察到的结果一致,在体外培养刺激的VSMCs中亦可观察到双层膜的自噬小体的形成,且CD137激动组自噬小体数量较多,而CD137抑制组自噬小体较激动组数量少。 (5)细胞钙化诱导实验中,CD137激动组平滑肌细胞BMP-2及Runx2蛋白表达水平高于对照组(3.39±0.32 vs1.25±0.57,2.48±0.17 vs0.88±0.08,P<0.01),而CD137抑制组 BMP-2、Runx2蛋白表达水平较 CD137激动组低(2.42±0.14 vs3.39±0.32,2.39±0.15 vs2.48±0.17,P<0.05)。vonKossa钙化染色结果显示,CD137激动组VSMCs钙化较对照组明显,而CD137抑制组细胞钙化较激动组减轻。 (6)体内实验显示:在ApoE-/-小鼠AS斑块中,与对照组相比,CD137激动组管腔结构紊乱,内膜破坏,连续性差,斑块中可见明显点灶状钙化,钙化面积增多(3.01±0.45 vs0.27±0.06,P<0.01),而CD137抑制组钙化面积较激动组减少(1.23±0.39 vs3.01±0.45, P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示:CD137激动组及抑制组ApoE-/-小鼠主动脉斑块中自噬早期标记蛋白 LC3B、Beclin1表达均高于对照组,激动组更明显。同样晚期标志蛋白p62的表达激动组高于抑制组。 结论: CD137信号可通过抑制自噬小体与溶酶体融合促进动脉粥样斑块钙化的形成。