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研究基因功能有很多方法,比如经典正向遗传学技术常用的紫外诱变、化学诱变、逆转录病毒或转座子介导的插入突变等,反向遗传学技术常用的TALEN、ZFN、CRISPR/Cas9等。尽管基因编辑的方法有很多,但小鼠的全基因组突变仍然是一项具有挑战性的任务。Sleeping Beauty(SB)转座子系统,自从1997年发现以来,常与基因捕获的方法协同作用,进行基因功能的研究。本课题采用的就是将SB转座系统与poly(A)-trap载体结合,以用于研究小鼠胚胎干细胞(mES)的插入突变。我们使用的poly(A)-trap载体含有缺乏poly(A)信号的新霉素(Neo)抗性基因的表达盒,其侧翼为SB转座子的两个反向末端重复序列。Poly(A)-trap的完整组件可以插入目标基因的TA二核苷酸,与内源基因正确剪接,同时使用1 μg/ml DOX瞬时诱导SB转座酶表达。能够有效中断mES细胞中被捕获到的基因的转录从而形成多个G418抗性细胞克隆。首先在已有基础上构建了新的poly(A)捕获载体 pT2/Poly(A)-trap-Short、pT2/Poly(A)-trap-ES 及诱导表达 SB11转座酶的转座酶载体pCMV-rtTA · TRE-SB11。这两个捕获载体pT2/Poly(A)-trap-Short和pT2/Poly(A)-trap-ES上包括基因识别组件和基因破坏组件。转座酶载体pCMV-rtTA·TRE-SB11则是通过Tet-on系统诱导表达SB11转座酶,从而提高突变效率。我们通过Tet-on系统所需的DOX对滋养层细胞、小鼠胚胎干细胞的生长增殖等不同层面的影响情况,确定了 DOX合适的使用浓度及使用时间。对得到的突变小鼠胚胎干细胞品系进行了胚胎干细胞特性如全能性、自我更新能力、遗传稳定性、分化潜能等的检测,明确了我们使用的转座子及捕获载体和诱导方式、筛选方法对小鼠胚胎干细胞应具备的特性不会造成显著的破坏,可使它们尽可能得到最大程度的维持。同时还对构建突变小鼠胚胎干细胞品系的方案进行了一定程度的优化,将转座效率从10%左右提高到了 42%左右。最终我们基于SB转座子确定了一套完整的方法体系用于构建突变小鼠胚胎干细胞品系。在数次突变筛选中,我们从二十三个细胞克隆中鉴定了六个转座事件,其中四个插入内源基因,两个位于内源基因之间。Syngap1+/-细胞自我更新、全能性、遗传稳定性和分化的能力不受DOX处理和G418筛选的影响。这些发现表明,这种SB转座子系统介导的poly(A)捕获可用作大规模诱导小鼠胚胎干细胞基因突变和进一步产生突变小鼠品系的替代工具。