背景肝癌是我国常见消化道肿瘤,发病率高,手术复发机率大、预后差,其中绝大多数是为肝细胞癌,影响预后因素与肝癌细胞生物特性有密切关系。传统的组织病理学诊断方法有局限性,如现在利用肿瘤相关标志物如甲胎蛋白已经用于临床诊断、早期复发与预后,但存在一定假阴性和假阳性发生率,为能较好提供肝癌早期诊断及复发依据,从肿瘤基因方面进行肝癌早期诊断及肝癌转移研究意义重大。许多关于微小RNA (miRNA)和肝癌相关基因方面的研究表明,某些微小RNA在肝癌中通过表达上调起促癌基因作用,另外一些微小RNA又可以表达下调起抑癌基因作用,其机理可能是微小RNA对其靶基mRNA通过反向调控作用,分别在转录和翻译水平调控靶基因。肝癌细胞系有多种,从肝癌组织提取后经过培养传代过程,不改变其生物学性质。根据研究设计目的,选取不同的细胞系,再用人工方法将基因转染到病毒或质粒中,从而建立既有特定生物学特性又含有目的基因的肝癌细胞系。本研究采用肝癌细胞株SMMC-7721,特点是有较高的异体移植成功率,Huh7能检测到HBSAg, HepG2不含HBV,根据实验目的从这三种肝癌细胞目标基因表达水平量不同,选取符合要求的肝癌细胞。MiR-10b位于同源盒子基因HOXD10簇中间染色体2q31上,HOXD4与13附近,最初报道niR-10b在胶质瘤组织表达上调,在乳腺癌方面的研究逐渐增多,发现人和小鼠乳腺癌中高度表达,并且促进调控肿瘤细胞转移和侵袭,另一方面在非转移乳腺肿瘤细胞过表达miR-10b,可以抑制肿瘤细胞侵袭和转移促发机制,miR-10抑制了乳腺肿瘤细胞HOXD10的蛋白质翻译过程,导致增加具有亲转移RHoC基因表达,近来,发现1niR-10b在肝癌恶性肿瘤组织与肝脏非肿瘤组织比较miR-10b呈高表达。这些结果说明存在调控肿瘤细胞侵袭和转移通过miR-10b特异性的旁路。肿瘤转移及侵袭原因与miR-10b的关系密切,如与乳腺癌、胰腺癌、血液系统肿瘤、食道癌中都有异常表达,表达水平差异,可能与其靶基因受到调控作用机制不同有关。miR-10b的靶基因有许多,相互作用关系目前还不是很清楚,HOXD10基因是其中一种,根据相关文献报道该基因与多种肿瘤发生有关系密切。本研究关注的是mirR-10b与其可能靶基因HOXD10在肝癌细胞中表达情况和该基因部分功能。基因HOXD10同样位于2号染色体,是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点。HOXD10属于同源盒子家族其中一种,HOXD10基因与肿瘤的关系研究,目前处于初步阶段,主要涉及乳腺癌、血液病、食道癌、胶质瘤方面的研究。关于肝癌与miR-10b的靶基因HOXD10关系,目前少见相关文献报道,本实验对三种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC27利用SYBR GREEN实时荧光定量PCR方法来检测HOXD10mRNA表达的方法,并分析HOXD10基因在肝癌细胞Huh7、 HepG2、SMMC27中的表达情况。依据聚合酶链反应机理,实验反应中荧光发出信号会发生变化,并可以绘制成对应的曲线,来测定PCR生成物的量,得出曲线与标准曲线做分析,得到的未知样品最小循环数值(CT)。目前荧光检出方法有荧光荧光探针法和嵌合法。该实验采用荧光嵌合法,通过对荧光强度的检测,来检测目的基因PCR扩增产物量。采取标准曲线相对定量法,进行相关基因功能方面研究,同时为了校正不同样本间RNA质量和逆转录效率的不同,18s rRNA基因及U6作看家基因,来比较样品中目的基因表达量。PCR反应的专一性可通过标准曲线分析出来；如果溶解曲线是单一峰型说明生成产物符合要求,出现两个以上峰型,说明有其他引物生成。在本实验中,我们通过对溶解曲线分析推断扩增目的产物特异性。研究细胞基因功能的主要方法,是将外源性分子遗传物质转入真核细胞内,分为两种：瞬时转染外源遗传物质不整合到宿主染色体内,可以产生表达量高,持续时间短,需要在转染后24-72小时内分析结果。稳定转染是外源遗传物质整合到宿主染色体内。本实验采用脂质体瞬时转染法,因为该方法适用细胞广、高转染效率,可重复性。细胞侵袭实验为在特殊培养基中建立模性结构,该膜结构与细胞基底膜类似。设置滤膜孔径使细胞不能自由通过,必须分泌相关酶,及变形运动后穿过滤膜,形成跟体内细胞游走情况相似,并可以进行侵袭分析。目的探讨miR-10b其靶基因HOXD10在肝癌细胞表达和侵袭能力影响。分析基因HOXD10在肝细胞癌三种细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中基础表达量,筛选HOXD10表达量高的细胞株。miRNA10bmimics转染肝癌细胞后,分析是通过抑制蛋白质翻译过程或降解信使RNA方法来调节靶基因HOXD10的作用,并进一步研究对HepG2侵袭性功能的影响。方法1.培养Huh7、HepG2、SMMC-7721三种细胞株。2.从三种细胞提取总RNA,通过逆转录合成模板链。3.用生物信息学方法预测miRNA—10b靶基因HOXD10,及得到HOXD10和18srRNA基因完整序列,采用广州锐博生物公司设计合成miR-10b序列。4.分别以三种肝癌细胞逆转录的第一链为模板扩增HOXD10和18srRNA基因片段,得到相对定量样品,根据三种肝癌细胞株中HOXD10基础表达量筛选出高表达肝癌细胞株。5.设立空白转染组为正常对照组(cell组),无关序列转染组为阴性对照组(NC),和实验组miR-10bmimics转染HepG2(miR-10b转染组),脂质体转染后并通过QPCR及Western blot行HOXD10基因及蛋白质水平进行分析验证,同时对肝癌细胞侵袭实验,细胞转染miR-10b后接种至侵袭装置,培养24h后对穿膜细胞计数。结果三种肝癌细胞核糖核酸电泳后均出现三条带,说明没有发生降解。Huh-7与SSMC-7721中HOXD10表达偏低,溶解曲线出现杂峰,而HepG2的溶解曲线则呈现单峰,表达量高为下一步实验提供较好的实验条件。利用RT-PCR检测肝癌细胞HepG2-HOXD102-ΔΔCt值228.71明显高于Huh1.00与SSMC-77211.55。Western Blot蛋白表达量同样是HepG2细胞升高。建立高表达miR-10b的HepG2细胞实验组与阴性对照组在基因水平和Westernblot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-△△CT分别是1.24±0.23、1±0.02,P>0.05差别无显著意义,在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1968.742,蛋白水平表达降低。体外细胞侵袭实验穿膜细胞数结果显示：HepG2转染miR10b过表达后112.38±11.27,与阴性对照组75.25±6.35比较细胞侵袭能力增加(P<0.05),而HepG2组与1miR-10b过表达阴性对照组无明显改变,表达miR-10b可增加肝癌细胞HepG2侵袭功能。结论实验结果说明三种肝癌细胞株中HOXD10在肝癌细胞HepG2中基础表达量升高,可能对该基因敏感性较强,考虑该基因可能为肝癌发生发展的抑制因子,确认miR-10b是通过翻译阶段抑制靶基因HOXD10,说明HOXD10受miR-10b的调控；MiR-10b过表达与肝细胞癌的侵袭关系密切,可以提示我们通过诱导促进侵袭转移的潜在靶基因沉默或诱导抑制侵袭转移的靶基因高表达而在临床上达到抑制肿瘤侵袭和转移目的。同时为进一步研究肝癌细胞的多种恶性特征,需要深入研究其作用机制,为miR—10b作为肝细胞癌诊断治疗的新靶标提供实验依据。