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目的:乳腺癌是目前女性最常见的癌症之一,也是影响女性生命的疾病之一。目前乳腺癌的发病机制尚不明确。在治疗方面,分子靶向治疗在乳腺癌的综合治疗中发挥重要作用,然而仍有部分乳腺癌患者,特别是三阴性乳腺癌患者的5年生存期未见明显改善。探索乳腺癌发生发展的机制,对于乳腺癌治疗策略的选择十分重要。越来越多的研究表明,长链非编码RNAs（long noncoding RNA,lncRNA）在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的进展中发挥重要调节作用。LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lnRNAs能够调控多种肿瘤的发生发展,发挥促癌基因或抑癌基因的作用。LncRNA SCAMP1-TV2（Homo sapiens secretory carrier membrance protein l transcript variant 2,genebank,NR110855）是SCAMP1基因的一个转录本,此转录本无法翻译成蛋白质。目前尚未见关于lncRNA SCAMP1-TV2在乳腺癌等癌症中的相关报道。RNA结合蛋白（RNA binding ptoteins,RBPs）是一类可以与hnRNA结合的蛋白,在基因调控过程中发挥关键调节作用。大部分的RNA是与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物,RBPs对于RNA的合成、选择性剪接、修饰、转运和翻译等生命活动的调控具有重要作用。因此,探索RNA与蛋白质的相互作用是研究RNA功能的关键。PUM2（Pumilio2）是PUF RNA结合蛋白家族成员之一。文献报道PUM2在体内结合750个独特的mRNA靶标,PUM2在髓系白血病以及膀胱癌中发挥转录后调节作用,目前尚未见PUM2在乳腺癌中表达与功能的相关研究报道。长链非编码RNAs可作为RNA结合蛋白的“分子海绵”或“分子支架”,调节RNA结合蛋白对下游基因的表达。本研究通过生物信息学软件预测分析发现SCAMP1-TV2与PUM2存在结合位点,提示SCAMP1-TV2可能通过结合PUM2发挥其生物学作用。转录因子（transcription factor,TF）是一类能与基因5’端上游特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。顺式作用元件可以和转录因子的DNA结合域实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。INSM1（Insulinoma-associated 1）基因定位于染色体20p11.2,由包含1530个核苷酸开放阅读框的2838碱基对序列组成,编码510个氨基酸。研究表明INSM1在甲状腺髓样癌,小细胞肺癌和宫颈癌中高表达,调节肿瘤细胞的生物学行为,尚未见INSM1在乳腺癌中的相关研究。研究发现PUM2可通过结合靶基因mRNA的3’-UTR降解靶mRNA,从而抑制基因的表达。本研究通过生物信息学软件预测分析发现INSM1的3’-UTR存在PUM2的潜在结合位点,提示PUM2可能通过调节INSM1的表达发挥其生物学作用。SASH1（SAM-and SH3-domain containing 1）是肿瘤抑制因子,能够抑制肺癌、胃癌和肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。文献报道SASH1主要通过降低PI3K/AKT信号通路的活性抑制癌细胞的增殖和侵袭等恶性生物学行为。研究表明SASH1在74%的乳腺癌中低表达,尚未见其调节乳腺癌生物学行为的报道。本研究首先明确SCAMP1-TV2、PUM2、INSM1、SASH1在乳腺癌组织和细胞中的内源性表达,进一步研究上述分子间的调控关系,以及对乳腺癌细胞生物学行为的调节,研究旨在揭示乳腺癌发生发展的新机制,同时也为乳腺癌的分子靶向治疗提供新靶点。研究方法:1.qRT-PCR方法检测SCAMP1-TV2在乳腺癌组织、MCF-7和MDA-MB-231细胞中的内源性表达。2.通过IHC、qRT-PCR和Western Blot检验PUM2、INSM1在乳腺癌组织、MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达。3.流式细胞术检测SCAMP1-TV2,PUM2、INSM1和SASH1对乳腺癌细胞凋亡的影响。4.构建 SCAMP1-TV2、PUM2、INSM1 和 SASH1 的表达沉默,PUM2、INSM1 和SASH1的过表达的稳定转染的MCF-7和MDA-MB-231细胞系,通过Transwell细胞迁移侵袭实验以及CCK-8细胞增殖实验研究其乳腺癌中发生发展的研究机制。5.RIP 实验和 pull-down 实验验证 SCAMP1-TV2 与 PUM2,PUM2 与 INSM1 的结合能力。6.ChIP实验和荧光素报告实验验证INSM1与SASH1启动子区的结合作用。7.通过Western Blot检验SASH1在乳腺癌细胞中对p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达的影响。8.裸鼠移植瘤实验进一步验证沉默SCAMP1-TV2和PUM2联合应用对于乳腺癌细胞在动物个体水平上的影响。结果:1.qRT-PCR检测发现SCAMP1-TV2在乳腺癌组织中高表达。qRT-PCR检测发现SCAMP 1-TV2在MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中高表达,沉默SCAMP1-TV2能够抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,并促进凋亡。2.IHC和qRT-PCR检测发现PUM2在乳腺癌组织中低表达。qRT-PCR和Western blot检测发现PUM2在MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中低表达,沉默PUM2后,CCK-8法及Transwell检测显示乳腺癌细胞增殖能力、迁移及侵袭能力增强,流式细胞术结果显示乳腺癌细胞凋亡显著降低。过表达PUM2后,结果趋势相反。RIP及RNA Pull-Down实验证明了 SCAMP1-TV2可以与PUM2结合。3.IHC、qRT-PCR检测发现INSM1在乳腺癌组织中高表达。qRT-PCR和Western blot检测发现INSM1在MCF-7和MDA-MB-23 1乳腺癌细胞中高表达,沉默INSM1后,CCK-8法及Transwell检测显示乳腺癌细胞增殖能力、迁移及侵袭能力降低,流式细胞术结果显示乳腺癌细胞凋亡增强。过表达INSM1后,得到相反的结果。4.qRT-PCR和 Western blot 检测发现沉默 SCAMP1-TV2 后,SCAMP1-TV2与PUM2的结合力降低,增加PUM2与INSM1 mRNA的结合,促进INSM1 mRNA的降解,进而导致INSM1的表达水平降低。CCK-8法及Transwell检测发现联合过表达PUM2及INSM1逆转了单独过表达PUM2对乳腺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用,并逆转了单独过表达INSM1对乳腺癌细胞恶性生物学行为的促进作用。5.qRT-PCR和Western blot检测发现过表达INSM1显著抑制SASH1 mRNA及蛋白的表达水平,而沉默INSM1促进SASH1 mRNA及蛋白的表达。双荧光素酶实验和ChIP实验验证INSM1可以与SASH1相结合,并明确结合位点。CCK-8法及Transwell检测发现SASH1能够抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。流式细胞术检测发现SASH1能够促进乳腺癌细胞凋亡。Western blot检测发现SASH1可以降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达,从而抑制PI3K/AKT信号通路的活性。6.裸鼠移植瘤实验结果示单独沉默SCAMP1-TV2或过表达PUM2组移植肿瘤重量大小明显减少,联合沉默SCAMP1-TV2、过表达PUM2组移植肿瘤重量大小最小。结论:1.在人乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中,SCAMP1-TV2和INSM1高表达,PUM2低表达,沉默SCAMP1-TV2或INSM1以及过表达PUM2显著降低乳腺癌的增殖、迁移侵袭能力。2.SCAMP1-TV2 结合 PUM2,降低 PUM2 与 INSM1 mRNA 的结合,降低 INSM1 mRNA的降解,进而上调INSM1的表达水平。INSM1与SASH1的启动子区直接结合,发挥转录抑制作用。3.沉默SCAMP1-TV2,通过减少结合PUM2,增加PUM2与INSM1 mRNA的结合,增加INSM1 mRNA的降解,进而下调INSM1的表达,促进对SASH1的转录,并通过抑制PI3K/Akt信号通路的活性,进而抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移侵袭能力,并促进凋亡。4.单独沉默SCAMP1-TV2或过表达PUM2及联合沉默SCAMP1-TV2与过表达PUM2显著抑制乳腺癌裸鼠移植瘤生长,联合应用的抑瘤效应更佳。