目的:在黏膜感染的过程中,HIV-1可以通过包膜蛋白表面的糖链与树突状细胞表面的C型凝集素受体 DC-SIGN结合,从而促进病毒在宿主体内的播散。在前期研究中,我们发现一组来自 HIV-1 AE2f包膜蛋白的糖基化位点能够与 DC-SIGN结合,具有潜在的阻断 HIV-1与 DC-SIGN结合的能力。为了验证其是否具有阻断 HIV-1感染的活性,本研究构建了表达包含上述糖基化位点的短肽,并通过体外实验验证其拮抗 HIV-1感染的能力。　　方法:(1)根据前期试验数据选取 HIV-1(AE亚型)V4环区382/388糖基化位点,进行6次串联重复设计,加上病毒自身信号肽和6×His标签,命名为 AE-Sexttet。序列交由上海捷锐生命科技有限公司合成。(2)将糖肽基因用BamH I/Xba I双酶切,克隆入真核表达质粒 pSV1.0。将得到的质粒在293T细胞中表达,收细胞裂解液进行WB验证表达,并通过分子量判断糖基化程度。(3)构建 DC-SIGN真核表达质粒并在293T细胞中表达,将表达 DC-SIGN的细胞裂解液作为 Lectin-Blotting结合液,与SDS-PAGE后电转印至 PVDF膜上的糖肽结合,通过检测结合到膜上的DC-SIGN判断糖肽的活性。(4)将糖肽基因构建到含 Neo基因的载体 pCDNA3.1(+),构建糖肽稳定表达质粒。将质粒转染 Hela细胞,G418抗生素筛选整合了重组质粒的阳性细胞克隆,建立稳定表达细胞系,通过 RT-PCR和WB鉴定表达分泌型糖肽的阳性细胞系。(5)扩大培养稳定表达糖肽的单克隆细胞系,收取细胞培养上清,通过 Lectin亲和层析的方式纯化糖肽,Western-Blotting验证纯化效果,Lectin-Blotting验证结合活性。(6)用TZM-bl细胞验证有、无糖肽的情况下,不同亚型 HIV-1病毒进入细胞的情况,根据荧光素酶活性高低判断糖肽拮抗 HIV-1假病毒粘附感染的生物学活性。　　结果:(1)瞬时转染后,Western-Blotting结果显示,目的蛋白的实际分子量远远大于预期分子量(前者为后者的约3倍);Lectin-Blotting结果显示,瞬时表达的糖肽分子能够与 DC-SIGN结合。(2)用重组 pCDNA3.1(+)-AE-Sexttet质粒将糖肽基因导入 Hela细胞并经过连续传代筛选之后,RT-PCR和Western-Blotting检测显示,分泌型糖肽稳定表达细胞株构建成功。(3) Western-Blotting结果显示,Lectin亲和层析纯化后的糖肽分子,分子量较均一(约40kDa);并且能够部分阻断 HIV-1假病毒向TZM-bl细胞表面粘附。　　结论:设计合成的糖肽基因可以在真核细胞中被正确表达并高度糖基化,并且能够部分阻断 HIV-1假病毒粘附靶细胞。本研究提示:由哺乳动物细胞天然表达的、HIV-1膜蛋白来源的糖肽分子能够在 HIV-1感染起始阶段的发挥一定的阻断作用。