论文部分内容阅读
目的:本研究旨在比较健康和慢性牙周炎两种不同来源的牙龈组织中血清淀粉样蛋白A2(serum amyloid A2,SAA2)的表达差异性;体外细胞实验检测人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)在受到Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2配体Pam3CSK4或TLR4配体大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,SAA2及炎性细胞因子表达的改变;TLR2或TLR4抗体中和实验检测SAA2的表达;以及siRNA抑制SAA2后,炎性细胞因子的表达,从而研究SAA2在慢性牙周炎的作用,初步探索SAA2与TLRs信号通路的关系,为进一步阐明牙周炎的发病机制提供新的实验依据。研究方法:1.经患者知情同意,收集就诊于天津医科大学口腔颌面外科及牙周科患者,根据纳入及排除标准筛选研究对象,获取牙龈组织后立即放入装有RNA保护液的离心管中或者装有福尔马林溶液的离心管中浸泡,备用。2.逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测健康及慢性牙周炎牙龈组织中SAA2 m RNA的表达;免疫组织化学方法检测健康及慢性牙周炎牙龈组织SAA2蛋白的表达及分布。3.将收集的健康牙龈组织,立即置入含有10%双抗的磷酸盐缓冲液中保存,采用组织块法体外培养HGFs。4.实时定量PCR检测不同浓度的Pam3CSK4(0、0.1、1、5、10μg/ml)或者E.coli LPS(0、0.1、1、5、10μg/ml)刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,SAA2及炎性细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的m RNA表达。5.抗体中和实验:TLR2抗体作用于HGFs,1μg/ml Pam3CSK4刺激后,实时定量PCR检测SAA2及细胞因子IL-1βm RNA表达。TLR4抗体作用于HGFs,1μg/ml E.coli LPS刺激后,实时定量PCR检测SAA2及细胞因子IL-1βm RNA表达。6.siRNA-SAA2转染健康HGFs,荧光显微镜观察转染效率,提取细胞总RNA及总蛋白进行RT-PCR及蛋白免疫印迹实验,检测SAA2的表达情况。7.siRNA-SAA2转染细胞后,实时定量PCR检测1μg/ml Pam3CSK4或者E.coli LPS刺激HGFs后炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、以及TLR4、TLR2、簇分化抗原14(cluster of differentiation 14,CD14)的表达。结果:1.健康及慢性牙周炎牙龈组织中均有SAA2 mRNA的表达,但是慢性牙周炎牙龈组织SAA2的表达较健康牙龈组织明显增高(p<0.05);免疫组织化学结果显示:慢性牙周炎牙龈上皮及纤维结缔组织细胞中有SAA2的表达,而健康牙龈SAA2表达不明显。2.组织块贴壁法体外培养HGFs,细胞形态为长梭形并呈放射状排列,生长活性较好。Real-time PCR结果显示:与对照组相比,E.coli LPS或Pam3CSK4刺激HGFs后SAA2、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αm RNA水平均有不同程度的升高。3.TLR2抗体阻断Pam3CSK4(1μg/ml)刺激HGFs后,IL-1β表达水平下降(p<0.05),SAA2表达无差异性(p>0.05)。TLR4抗体阻断E.coli LPS(1μg/ml)刺激HGFs后,SAA2、IL-1β表达水平均下降(p<0.05)。4.显微镜下观察Cy3荧光,细胞计数得出siRNA的转染效率约为75%。实时定量PCR检测siRNA对SAA2 m RNA的抑制作用约达99%;蛋白免疫印迹实验结果显示siRNA-SAA2可明显减少SAA2蛋白的表达。5.siRNA-SAA2转染后,1μg/ml Pam3CSK4刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,SAA2、IL-1β、IL-6表达明显下调(p<0.05),IL-8在6 h及12 h时明显下调,在24 h时明显上调(p<0.05)。TNF-αm RNA表达水平则在6 h、12 h、24 h时都增高,且具有统计学意义(p<0.05)。TLR2在6 h表达下降,12 h表达上调(p<0.05),24 h则无变化;TLR4的表达6 h没有变化,而在12 h及24 h表达上调。CD14在6 h表达下降(p<0.05),12 h及24 h表达增加(p<0.05)。6.siRNA-SAA2转染后,1μg/ml E.coli LPS刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,可见,SAA2、IL-1β、IL-6、IL-8明显的下调(p<0.05),而TNF-α在6 h和24 h时m RNA表达水平增加(p<0.05),12 h时变化无统计学意义(p>0.05)。TLR2在6 h及12 h表达降低(p<0.05),24 h(p>0.05)变化无统计学意义。TLR4在6 h表达量下降(p<0.05),12 h及24 h表达上调(p<0.05)。CD14在6 h时表达无差异(p>0.05),12 h及24 h表达上调(p<0.05)。结论:1.SAA2可能参与慢性牙周炎的炎症过程。2.HGFs中SAA2的诱导TLR4途径关系密切。3.SAA2可能通过TLRs途径影响HGFs中炎症细胞因子的表达。