第一部分MDM4在参与甲基苯丙胺激活小胶质细胞中的作用机制研究研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一种神经兴奋性人工合成毒品,属于苯丙胺类兴奋剂之一,其分子结构类似于神经递质儿茶酚胺,易溶于水、酒精等溶剂,因外观类似冰晶,故又称“冰毒”,在世界各国广泛滥用,其危害公共卫生及社会安全的趋势愈发严重,是目前全球范围内对公共卫生及社会安全危害最严重的毒品之一。METH最开始是作为一种控制食欲的药物在使用,后衍变为精神类毒品,其可以给吸食者带来短暂的身心愉悦的状态,与此同时也带来危害严重的副作用。吸食甲基苯丙胺后主要对中枢神经系统、心血管系统及肝、肾等脏器造成损伤。目前已有文献表明:甲基苯丙胺毒性作用的靶器官是人体的中枢神经系统,可以导致中枢神经系统中神经元的凋亡自噬、星形胶质细胞的炎症反应和自噬及可引起小胶质细胞的激活等反应,上述中枢神经系统中的细胞的功能紊乱也可以导致如亨廷顿、帕金森等神经性退行性变症状的出现,最终影响神经系统的正常功能。本课题组一直致力于甲基苯丙胺神经毒性研究,本课题组已经发现甲基苯丙胺能够引起神经元凋亡及星胶的炎症反应。除此之外,亦有大量临床及死后病理解剖数据显示,长期吸食冰毒者的脑部除存在神经元凋亡、星形胶质细胞激活,还伴随着神经炎症反应的存在。神经炎症反应在中枢神经系统中扮演着十分重要的角色。神经系统炎症反应同中枢神经系统中间质细胞(如星形胶质细胞、小胶质细胞)有着密切的关系,尤其是小胶质细胞,其约占脑中细胞数量的10-20%之间,数量同神经元数量相当,位于大脑应对外来有害刺激的最前线。小胶质细胞作为中枢神经系统内一种特化的免疫细胞,它的存在在维持脑正常功能发挥着重要的作用,可以不断清除中枢神经系统中其他细胞凋亡产生的凋亡小体、外来物质、局部感染等,在维持中枢神经系统稳态方面发挥着十分重要的作用,尤其是在帕金森、多发性硬化及阿尔茨海默症等中枢神经系统疾病的发展过程中。前期本课题组主要研究内容是METH所致神经元凋亡、自噬及METH诱导的星形胶质细胞自噬、炎症通路机制的研究等,在此基础上,开展了微小RNA(micro RNA,miRNA)对METH所诱导的星形胶质细胞自噬、炎症调控作用的研究。在METH导致的星形胶质细胞自噬、炎症细胞模型中,通过miRNA芯片检测筛选到差异性表达的miRNA,其中miR-10lb-3p上调明显。根据miR-10lb-3p的RNA序列,利用生物信息学技术筛选到MDM4是miR-10lb-3p调控的可能靶点。但在随后的实验中发现,miR-l0lb-3p对MDM4的调控作用甚微,MDM4对自噬及炎症的调控存在一定作用但效果并不稳定且不显著,故研究重心从miR-10lb-3p对星形胶质细胞自噬、炎症的调控机制研究转移到MDM4对星形胶质细胞自噬、炎症的调控机制研究。但MDM4在星形胶质细胞中对自噬及炎症的调控存在一定作用但效果并不稳定且不显著,推测可能是由于星形胶质细胞并非中枢神经系统的专职炎症细胞而导致的。意外的是,虽然MDM4在METH导致的星形胶质细胞中的调控作用不明显,但在研究中发现在小胶质细胞内,METH可诱导MDM4表达上调并促进小胶质细胞的自噬及炎症的发生,且MDM4对自噬及炎症的调控效果显著。这一结果,促使了我们对MDM4的上调与自噬的发生及炎症的激活三者之间的关系产生强烈的探讨兴趣,拟通过本研究对METH处理的小胶质细胞中MDM4、自噬及炎症的相互调控关系的研究,探讨甲基苯丙胺在激活小胶质细胞中的可能作用机制。目的:本研究拟通过建立METH神经毒性体外模型,利用免疫学及分子生物学等技术,探讨在METH诱导的小胶质细胞激活中MDM4的作用机制,并通过分子生物学手段调控MDM4的表达,检测MDM4对小胶质细胞激活的调控作用及可能涉及到的分子通路,从而研究METH诱导小胶质细胞活化的可能分子机制,为进一步明确MDM4在METH激活小胶质细胞活性中的调控机制奠定基础方法:1.METH诱导小胶质细胞自噬及MDM4升高模型建立(l)接种BV2细胞细胞至6孔板中,5%C02和37℃条件下培养细胞,待长至60-80%汇合程度时,分别用溶于2%FBS的DMEM高糖培养基的METH浓度为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L处理24小时。提取总蛋白,Western Blot检测MDM4的表达水平及自噬相关分子的表达水平,根据METH浓度梯度处理后MDM4的变化趋势确定合适的METH给药浓度。(2)根据上述实验的结果中MDM4及自噬的变化趋势,选择最适合的METH处理浓度,并以该浓度处理0h、6h、12h、24h、36h及48h,以此建立时间梯度处理实验,处理相应时间后,提取总蛋白,Western Blot检测细胞MDM4的表达水平及自噬的分子的表达水平,根据METH时间梯度处理后MDM4的变化趋势确定合适的METH给药时间。2.MDM4在小胶质细胞自噬、活化中作用(1)根据MDM4的mRNA序列,设计MDM4的siRNA干扰片段,使用lipo-3000脂质体转染说明书的方法转染siRNA,将BV2分为8组,分别是空白对照、对照+小干扰1、对照+小干扰2、对照+小干扰3、给药组、给药+小干扰1、给药+小干扰2、给药+小干扰3,处理24小时后,Western Blot检测细胞MDM4的表达水平自噬及炎症反应的变化情况,根据结果选择有效的特异性siRNA。(2)选择MDM4特异性化学抑制剂GSC-207895,根据既有文献推荐的浓度,设置5个浓度梯度,范围浓度分别为0μM/L、1μM/L、2μM/L、3μM/L、4μM/L,预处理24h,之后给予终浓度为2mM的METH处理24小时,提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞MDM4的表达水平自噬及炎症反应的变化情况。3.MDM4通过自噬途径介导METH诱导的小胶质细胞活化(1)根据ATG5的mRNA序列,设计ATG5的siRNA干扰片段,使用lipo-3000脂质体转染说明书的方法转染siRNA,将BV2分为4组,分别是空白对照组、对照+小干扰、给药组、给药+小干扰,处理24小时后,Western Blot检测MDM4的表达水平自噬相关分子的表达水平,并利用qRT-PCR检测炎症因子变化水平。(2)选择自噬特异性化学抑制剂3-MA,根据既有文献推荐的处理浓度及时间即2mM,处理24h后,给予终浓度为2mM的METH处理24小时,分为4组,分别是METH(-)3MA(-)组、METH(-)3MA(+)组、METH(+)3MA(-)组及METH(+)3MA(+)组,Western Blot检测MDM4的表达水平及自噬相关分子的表达水平,并利用qRT-PCR检测炎症因子变化水平。结果:1.METH诱导小胶质细胞自噬及MDM4升高模型建立(1)分别以0mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L和3 mmol/L终浓度METH处理BV2细胞,Western Blot结果显示MDM4随着METH处理浓度的升高,呈先上升后下降的趋势,MDM4的表达量在2 mmol/L时比0 mmol/L的control组相比显著升高,自噬表达趋势同MDM4表达趋势。(2)用2 mmol/L METH终浓度分别处理BV2细胞0h、6h、12h、24h、36h、48h,Western Blot结果显示MDM4随着METH作用时间的增长,MDM4蛋白水平也随着上升,MDM4的蛋白表达在METH处理6小时后开始上升,在24小时达到峰值,后续基本维持较高水平,48小时开始出现下降趋势。2.MDM4在小胶质细胞自噬、活化中作用(1)使用MDM4 siRNA Oligo片段处理后,同METH组相比较,MDM4蛋白表达存在下降趋势。使用METH+siRNA3,MDM4的表达量同METH组相比下降明显最明显,使用METH+siRNA1或METH+siRNA2,MDM4的表达量同METH组相比下降不明显。同时检测自噬与炎症Maker基因,结果显示,与control组相比较,METH组自噬及炎症蛋白表达水平均有上升;而METH+小干扰组同METH组相比,相关蛋白表达降低。(2)选择MDM4特异性化学抑制剂GSC-207895,设置5个浓度梯度,范围浓度分别为0μM/L、1μM/L、2μM/L、3μM/L、4μM/L,预处理24h,之后给予终浓度为2mM的METH处理24小时,同METH组相比,MDM4的表达水平随MDM4特异性化学抑制剂GSC-207895升高,呈现先降低的趋势,自2mM起开始明显抑制MDM4的表达,3mM达到顶峰。同时检测自噬与炎症相关标志基因,结果如下,与METH组相比;而METH+GSC-207895同METH组比较而言,自噬、炎症相关蛋白表达降低。3.MDM4经自噬通路介导METH诱导小胶质细胞活化(1)使用ATG5 siRNA Oligo处理之后发现,同METH相比较,ATG5的表达下调。同时检测自噬与炎症相关分子表达水平,结果如下,与Control组相比,METH组自噬及相关炎症分子表达上调;而METH+小干扰同METH组比较而言,MDM4没有变化,仅炎症相关分子的表达降低。(2)选择自噬特异性化学抑制3-MA,,以终浓度2mM预处理24h,之后给予终浓度为2mM的METH处理24小时,同时检测自噬与炎症相关分子的表达水平,结果显示,与METH组相比,METH+3MA组MDM4没有变化,自噬相关分子下降明显,炎症分子下降明显。结论:1.METH处理BV2细胞MDM4及自噬通路分子升高。2.METH处理BV2细胞后,敲低MDM4及使用MDM4抑制剂处理后,MDM4下降,自噬及炎症通路分子下降,提示MDM4调控自噬及炎症的发生。3.METH处理BV2细胞后,敲低ATG5及使用自噬抑制剂处理后,MDM4没有明显改变,自噬及炎症通路分子下降,提示自噬位于MDM4下游及炎症通路的上游。第二部分木犀草素缓解甲基苯丙胺肝毒性机制初探研究背景:本课题组在研究甲基苯丙胺中枢神经系统损害作用的同时,亦有针对性的筛选拮抗甲基苯丙胺中枢神经系统毒性的天然药物。木犀草素(Luteolin)是一种黄酮类天然化合物,主要存在于水果、蔬菜及草药中,大量文献报道木犀草素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性,尤其是其在中枢神经系统发挥的相关作用:Fu.H.Sun,Y等报道木犀草素能够减轻因脊髓缺血再灌注损伤所导致的中枢神经系统的炎症反应、氧化应激及凋亡;Y.Kwon报道了木犀草素可能成为阿尔茨海默症潜在的治疗药物;S.F.Nabavi等报道了在大鼠体内木犀草素能够缓解αβ肽所致的认知障碍;M.Zuiki等证实木犀草素能够缓解由多能干细胞所分化神经元分泌的IL-6导致的星形胶质细胞增生。基于上述关于木犀草素缓解中枢神经系统损伤的文献报道,我们尝试假设木犀草素能够缓解METH所致的神经毒性。因木犀草素主要是是依靠经过体内代谢的活性成分发挥其生物学作用。故验证木犀草素缓解METH所致中枢神经毒性的模型在动物体内进行。遗憾的是,前期多次预实验并未发现木犀草素能减缓METH所致神经毒性的作用,意外的是,在对预实验大鼠进行系统病理检查的过程中,发现METH对肝脏造成的肝毒性可被木犀草素缓解。后又进行多次动物实验,病理学显示木犀草素确实能够有效减轻METH所致肝毒性,另亦有相关文献报道木犀草素能够缓解由四氯化碳、氯化汞、酒精等毒药物所导致的肝损伤,佐证了木犀草素的护肝作用。然而,木犀草素缓解甲基苯丙胺所致肝毒性的具体机制尚不得知。高通二代测序RNA-seq技术为挖掘可能的调控分子及通路提供了可能,故本实验利用RNA-seq研究木犀草素减缓METH所致肝毒性的分子机制及调控网络。目的:本研究拟通过建立METH动物体内肝毒性模型,在此基础上检测木犀草素对METH所致肝毒性的缓解作用,并运用转录组测序技术,检测木犀草素缓解METH肝毒性可能调控的基因转录表达、潜在通路及可能分子机制,为进一步研究木犀草素对METH所致肝毒性减轻作用的分子机制及调控网络。方法:1.木犀草素减轻METH所致肝毒性动物模型的建立选择200g-220g SD雄性大鼠,设立对照组,METH组,木犀草素加METH组三组,对照组无处理,METH组,按照15mg/kg给药,每12小时给药一次,共8针,木犀草素+METH组,前3天木犀草素灌胃每次100mg/kg,每天一次连续三天,后给予METH处理,取肝脏组织固定,进行HE染色,取血清并检测血清中AST及ALT浓度。2.RNA-seq结果分析取建立模型中大鼠的肝脏组织,于-80℃保存,每组3个样本,共三组分别是对照组,METH组,木犀草素加METH组三组,提取总RNA,质检后上机测序,初步结果进行测序后相关分析。3.RNA-seq结果验证选取结果中的差异表达基因,进行qRT-PCR验证基因表达情况,验证测序结果的可靠性及可重复性。结果:1.木犀草素减轻METH所致肝毒性(1)组织病理学显示,空白对照组肝脏组织完好,METH组肝脏组织可见弥漫性气球样变,木犀草素+METH组的程度介于空白对照组及METH组之间,其有较轻程度的细胞水肿样改变。(2)生物化学指标检测,血清中AST及ALT,空白对照组AST及ALT处于正常水平,METH组AST及ALT水平显著升高,木犀草素+METH组血清中AST及ALT介于空白对照组及METH组之间,较METH组有明显的下降。2.RNA-seq结果分析与对照组相比,在METH处理组中鉴定出1859个DGE,包括873个上调的和786个下调的DGE。同时,在用木犀草素预处理的组中,与METH处理组相比,过滤了899个上调的和978个下调的DGE。最后,发现包括314个上调和183个下调DGE的497个DGE可能具有保护作用。并利用497个差异表达的基因进行GO分析及KEGG分析得出,通过KEGG途径分析富集了八个途径,氧化磷酸化,非酒精性脂肪肝病(NAFLD),PPAR信号通路和AMPK信号通路主要是富集途径。3.RNA-seq结果验证为了确认mRNA测序结果的准确性,选择6个基因以使用定量实时PCR验证测序结果。与对照组相比,Leap2,Fasn,Fabp5和Pnpla3在METH组中是上调的DGE,并且Mbp和Calm3是在3组中没有变化的基因。qRT-PCR的结果与mRNA测序的结果基本一致。结论:1.木犀草素能够有效减轻由METH导致的肝毒性2.497个差异表达基因及8个信号通路可能参与到木犀草素缓解肝毒性作用中,根据此分析出可能的通路及潜在的机制。2.qRT-PCR的结果与mRNA测序的结果基本一致,提示RNA-Seq结果具有较高的准确性及可重复性。