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AuroraB激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，是染色体乘客复合物（CPC）的催化亚基。哺乳动物中的研究表明，Aurora B激酶是细胞有丝分裂过程中染色体浓缩与定位、姐妹染色体分离以及胞质分裂必不可少的调控因子。Aurora B激酶在哺乳动物细胞周期进程中的功能研究已有丰富积累，在家蚕等昆虫中的研究极少。我们在本研究中对家蚕Aurora B激酶（BmAurB）基因进行了全长cDNA序列克隆和表达谱分析，利用RNAi等技术分析了BmAurB在家蚕细胞周期中的功能，并利用标记定量磷酸化蛋白质组学策略对Aurora B激酶的底物蛋白进行了鉴定分析。 本研究主要内容包括：⑴利用果蝇Aurora B基因的氨基酸序列在家蚕基因组数据库中进行同源性检索，发现家蚕预测基因BGIBMGA002350与果蝇Aurora B高度同源。以此为基础，进一步利用5’和3’RACE方法克隆得到家蚕Aurora B激酶（BmAurB）基因的全长cDNA序列（GenBank accession number：KX420635）。BmAurB基因全长为1090bp，135-1005bp区域是开放阅读框，共编码289个氨基酸。将全长cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对发现，BmAurB基因有6个外显子和5个内含子。利用在线SMART程序预测发现BmAurB基因的氨基酸序列含有一个保守的起磷酸化作用的S_Tkc结构域。⑵利用双链 RNA瞬时干涉及特异抑制剂处理等方法降低家蚕卵巢来源的BmN4-SID1细胞中的 BmAurB激酶表达或活性，然后通过流式细胞分析来探索BmAurB激酶在细胞周期进程中的调控作用。结果表明，针对BmAurB的双链RNA瞬时干涉及特异抑制剂处理都会使细胞周期被阻断在G2/M期，并引起DNA含量大于4N的细胞的积累。进一步利用免疫荧光染色方法观察细胞形态发现，在BmAurB激酶的表达或活性降低后，细胞有丝分裂前中期可发生染色体迁移异常，以至于中期出现染色体位置错乱而不能整齐排列在赤道板上；有丝分裂后期姐妹染色单体不能正常分离而形成染色体桥，或发生不均等分离；胞质分裂被阻滞，两个子细胞不能分离而生成双核细胞。进一步的Western Blot实验表明，调控G2/M期转换的关键蛋白CDK1以及标记处于分裂期细胞的磷酸化组蛋白H3（pH3）的磷酸化水平随着BmAurB激酶活性下降而降低。上述结果表明BmAurB激酶活性降低严重阻碍了家蚕的细胞周期进程。⑶基于同位素标记的定量磷酸化蛋白质组学策略对Aurora B激酶新的潜在作用靶标进行了鉴定分析。鉴于家蚕细胞周期难于同步化，我们拟用人胚肾来源的HEK293-FT细胞进行该研究。首先利用CDK1抑制剂RO3306对HEK293-FT细胞进行同步化处理，使大部分细胞停滞在G2期。然后更换培养基，一部分细胞用正常培养基培养（对照组），一部分细胞用添加了Aurora B抑制剂AZD1152-HQPA的培养基培养（实验组），每组实验设3个重复；当培养40 min的对照组细胞进入有丝分裂中期时，即刻收集对照组和实验组细胞，并分离纯化总蛋白。Western blot分析显示，AZD1152-HQPA抑制剂处理导致细胞中H3的磷酸化水平降低。对实验组和对照组的每个蛋白样品进行胰酶消化后，利用TiO2方法富集待测样品中的磷酸化肽段，再通过标记定量磷酸化蛋白质组学技术对磷酸化肽段进行鉴定分析。从实验组和对照组的6个样品中，我们共鉴定到8903个磷酸肽段，通过数据库比对将这些肽段匹配到3364个磷酸化蛋白。根据差异倍数≥1.2或者≤0.83以及p值＜0.05的通用参数，我们对鉴定到的磷酸化肽段进行定量分析并发现，16个磷酸化蛋白的25个磷酸化肽段发生上调，32个磷酸化蛋白的36个磷酸化肽段发生下调。GO分类显示，这些差异磷酸化蛋白均具有催化活性，主要参与信号传导和细胞周期进程等生物学过程。除了H3和H1等已经证实为Aurora B的磷酸化底物蛋白外，我们新发现参与维持染色体结构的 CBX5以及微管结合蛋白RP/EB等可能是 Aurora B的磷酸化靶蛋白。进一步利用 RNAi方法降低BmN4-SID1细胞中的CBX5基因表达量，出现胞质分裂阻滞而产生双核细胞，与BmAurB基因干涉结果一致。下一步我们计划结合人及家蚕细胞对Aurora B新的潜在靶蛋白进行深入研究。