无论从改善胴体角度还是人类健康角度,对于脂肪发育机制的研究已经成为国内外研究的热点。脂肪组织的发育起源于中胚层的多能间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)“定向”为前脂肪细胞,以及随后的前脂肪细胞“终末分化”为成熟脂肪细胞,即脂肪生成(adipogenesis)。过去近二十年的研究表明,脂肪生成是受到精细的转录级联调控网络严格控制的过程,其中转录因子及其共因子发挥着主要调控作用。转录因子PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是调控前脂肪细胞分化的核心因子,且其它转录因子如KLFs、STAT5a/b、E2F1、C/EBPs等是通过直接调控PPARγ的表达,以及转录共因子如PRIP、TLE3、SND1等是通过与PPARγ互作影响其转录活性来调控脂肪细胞分化的。近年来,相继发现了BMP4、Wnt和Hedgehog信号是决定成脂定向的主要信号,以及锌指蛋白(Zinc finger protein,Zfp)423、Zfp467、Zfp521、Zfp395和ZEB1等调控MSCs成脂定向的作用也被确认,但目前调控早期成脂定向的分子机制及相关转录调控网络尚不明晰。本研究的内容分为三部分:第一部分主要是克隆猪Rb1基因,以及研究其作为转录共因子调控成脂定向的作用;第二部分筛选并鉴定了新的调控成脂定向的关键转录因子Bcl6,以及阐明Bcl6调控MSCs成脂定向的作用;第三部分利用RNA-seq(RNA sequencing,RNA-seq)手段筛选了Bcl6调控的靶基因,以及鉴定了Bcl6调控MSCs成脂定向过程所依赖的关键结构域与相互作用蛋白Ebf1,从而阐明Bcl6调控MSCs成脂定向的分子机制。第一部分,克隆猪Rb1及其调控DFAT(Dedifferentiated fat cells,DFAT)细胞成脂定向的功能。本研究首次克隆了包含猪Rb1基因编码区(coding sequence,CDS)的c DNA序列,并进行了生物信息学分析。进一步,研究了si RNA敲低Rb1的表达对猪DFAT细胞成脂定向分化及对E2F转录活性的影响,以探讨Rb1调控脂肪生成的可能机制。主要的结果如下:1.PCR成功扩增得到长度为3033bp的猪Rb1基因c DNA片段,其中CDS全长为2820 bp,编码939个氨基酸残基,包含SCOP结构域、未知功能结构域、Rb-A口袋结构域、CYCLIN结构域和C末端结构域。生物进化树分析显示,猪Rb1与牛和人的进化关系最近。2.猪Rb1基因在各种组织中广泛表达,其中在心脏、肝脏、肌肉和胃中表达量最高,其次是肺和脂肪组织,在肾、脾和小肠中相对表达最低。3.Rb1在DFAT细胞成脂定向早期下调表达,随后上调。敲低Rb1表达促进了DFAT细胞成脂定向分化,分化第8d成脂关键转录因子PPARγ与标志基因a P2、LPL和Adipo Q的m RNA表达显著上调(P<0.05),及PPARγ和Adipo Q蛋白表达显著上调。但是棕色脂肪细胞标志基因Fox C2和Ucp1变化不显著(P>0.05)。表明,早期敲低Rb1的表达促进DFAT细胞分化为白色脂肪细胞,而非棕色脂肪细胞。4.在DFAT细胞早期分化过程,敲低Rb1的表达促进了细胞增殖相关基因CCNA2和CCNE1的表达(P<0.05),以及极显著上调了E2F的转录活性(P<0.01),表明Rb1调控DFAT细胞成脂定向分化可能是通过调控E2F的活性来影响克隆性增殖和PPARγ表达实现的。第二部分,鉴定新的成脂定向因子锌指蛋白Bcl6。本试验在实验室前期RNA-seq数据的基础上通过生物信息学分析、QPCR验证与si RNA干涉手段筛选到新的调控成脂定向的锌指转录因子Bcl6;随后研究了Bcl6在猪和小鼠不同成脂能力的细胞中的表达情况及组织表达谱;分别用QPCR和Western Blot研究了Bcl6在小鼠C3H10T1/2细胞成脂定向分化过程中m RNA和蛋白的表达模式,以及免疫荧光试验分析了Bcl6在成脂早期定向过程的蛋白表达变化;最后以猪原代SV(stromal vascular,SV)和小鼠C3H10T1/2细胞(间充质干细胞系)为材料,进行功能“获得”和“缺失”研究了Bcl6对干细胞增殖和定向分化的影响,阐明了Bcl6在干细胞成脂定向中的作用。主要的结果如下:1.通过生物信息学分析和QPCR验证,我们确定了8个在SV细胞成脂早期上调表达,且在已鉴定的早期定向关键基因启动子区域存在结合位点的候选转录因子。进一步研究发现,si RNA敲低Bcl6明显抑制了SV细胞成脂定向分化。2.Bcl6在成脂能力强的前脂肪细胞3T3-L1中高表达,这一模式类似于已鉴定的成脂定向关键因子Zfp423;小鼠Bcl6在1周和8周龄的脂肪组织中均高表达;而且Bcl6的m RNA和蛋白表达均在C3H10T1/2细胞成脂定向早期显著上调,在第2d表达量最高,随后下调。3.在C3H10T1/2细胞中,si RNA敲低Bcl6显著提高了细胞增殖指数(P<0.05);利用猪SV细胞为材料研究也得出了一致的结果。过表达Bcl6显著降低了细胞增殖指数(P<0.05)。Ed U染色表明,过表达Bcl6抑制了C3H10T1/2细胞的DNA合成。4.猪SV细胞中,si RNA敲低Bcl6明显抑制了细胞成脂分化表型和分化第8天成脂关键转录因子PPARγ与标志基因a P2、LPL和Adipo Q的m RNA表达。而且敲低Bcl6明显抑制了C3H10T1/2细胞定向分化为成熟的脂肪细胞,以及分化第8天细胞甘油三酯含量(P<0.01)、成脂基因PPARγ2、a P2、LPL和Adipo Q的m RNA表达(P<0.01)和PPARγ和Adipo Q蛋白的表达。5.C3H10T1/2细胞过表达Bcl6用MDI处理后发现成脂分化表型并无明显改变,而用MDII处理后发现,促进了分化第8天成脂关键转录因子PPARγ2与标志基因a P2的表达(P<0.05)。因此,过表达Bcl6具有协同促进MDII诱导MSCs成脂定向分化的作用。6.SV和C3H10T1/2细胞中敲低Bcl6均抑制成脂早期调控基因Zfp423、Zfp467等的表达。敲低Bcl6表达的同时过表达PPARγ发现,过表达PPARγ挽救了细胞的成脂分化能力,极显著提高了分化第8天细胞的甘油三酯含量(P<0.01),说明Bcl6在成脂转录级联过程中先于PPARγ发挥作用。第三部分,Bcl6调控干细胞成脂定向的分子机制。本试验利用RNA-seq手段来筛选Bcl6调控的靶基因。通过将干涉和过表达Bcl6情况下的同步差异表达基因(differential expression genes,DEGs)与SV细胞成脂早期DEGs数据(SRA092066)进行映射,筛选得到的“重叠基因”可能是Bcl6在MSCs成脂定向过程直接作用的靶基因。进一步靶定了STAT1和Nmi可能是Bcl6在干细胞成脂定向过程作用的靶基因。因此,通过研究干涉或过表达Bcl6对STAT1和Nmi表达的影响,以及在干涉Bcl6的C3H10T1/2稳定细胞成脂定向过程和高脂日粮诱导的肥胖小鼠脂肪组织中Bcl6及其靶基因STAT1和Nmi的表达模式,旨在阐明Bcl6与STAT1和Nmi之间的调控关系。随后通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)试验和启动子活性试验证明了STAT1是Bcl6直接作用的靶基因。最后,探讨了Bcl6调控MSCs成脂定向所依赖的结构域和可能相互作用的蛋白。主要的结果如下:1.RNA-seq结果筛选到207个干涉和过表达Bcl6情况下的同步DEGs,其中125个受Bcl6正调控,82个受Bcl6负调控。2.同步DEGs的GO分析显示,它们主要在免疫应答、细胞因子和激素分泌调节,以及防御应答等生物过程存在显著性富集(P<0.05);没有信号通路被显著性富集。随后,将这207个同步DEGs与SV细胞成脂早期上调或下调表达的基因进行映射,得到18个Bcl6正调控且成脂早期上调表达和3个Bcl6负调控且成脂早期下调表达的靶基因。3.在C3H10T1/2细胞中敲低Bcl6靶基因的表达结果显示,敲低STAT1和Nmi均明显抑制了成脂定向分化表型。进一步研究发现,敲低或过表达Bcl6分别显著抑制和促进了STAT1、Nmi的表达。在野生型和干涉Bcl6的C3H10T1/2细胞成脂定向过程中,Bcl6和STAT1的表达模式一致,均在成脂早期上调表达,48h时达到峰值,且干涉Bcl6显著下调STAT1的表达。而Nmi的表达模式与Bcl6不同。4.在高脂日粮诱导的肥胖小鼠中,Bcl6在白色脂肪组织中上调表达,在棕色脂肪中下调表达,STAT1的表达变化与Bcl6一致。表明,STAT1可能是脂肪发育过程中Bcl6直接作用的靶基因。5.Ch IP试验结果显示,在C3H10T1/2细胞成脂定向过程中,Bcl6可以结合至STAT1基因启动子区域。启动子活性报告系统也证实了Bcl6可以结合STAT1基因的启动子。表明,STAT1是Bcl6在干细胞成脂定向中直接结合调控的靶基因。6.在C3H10T1/2细胞成脂定向中,缺失Bcl6的PEST和ZF结构域均阻止了其促进成脂定向的作用及靶基因STAT1的表达。而且成脂关键因子Ebf1与Bcl6的相互作用协同促进STAT1的表达。综上所述,本研究的结论是:1、克隆鉴定了猪转录共因子Rb1基因,证实Rb1是负调控猪脂肪生成的关键因子。2、鉴定了新的转录因子Bcl6是猪和小鼠干细胞成脂定向的关键因子。Bcl6在干细胞成脂分化早期抑制增殖,促进成脂定向分化。3、初步阐明了Bcl6调控MSCs成脂定向的可能机制,Bcl6通过直接结合至靶基因STAT1启动子上转录激活STAT1的表达来影响干细胞的成脂定向,而且这一调控作用与其PEST和ZF结构域密切相关。