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目的缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,IRI）是急性肾损伤（acute kkidney injury,AKI）的主要原因,与包括肾脏移植在内的许多临床疾病有关。目前缺乏阻止AKI进展的特异性治疗手段,亟需开发新的治疗靶点和方案。肾病包括糖尿病肾病、和与免疫细胞亚群紊乱关系密切的肾缺血再灌注损伤。本研究试图揭示固有淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILC）在肾脏疾病发病机制中的重要作用和治疗靶点,探究体外扩增2型固有免疫细胞（ILC2）在小鼠肾病模型和人源化小鼠模型中的治疗潜力。方法1.IL-33增强组织驻留型ILC2预防肾脏缺血/再灌注损伤以IRI模型为研究对象,观察IL-33预处理对AKI的作用。6-8周的雄性C57BL/6小鼠在37℃将两个肾蒂分别夹30min,缺血期后,释放动脉夹引起再灌注。对于IL-33处理组,在IRI手术前连续5d腹腔内注射0.3μg小鼠重组IL-33。BALB/c小鼠分为三组:对照组、安慰剂的IRI组和IL-33治疗的IRI组,1d后处死小鼠,检测血清肌酐、IL-4、IL-13水平,PAS染色检测肾脏结构和肾小管损伤,通过定量PCR检测肾脏中IL-4、IL-13以及炎性因子的m RNA表达,免疫荧光检测中性粒细胞和巨噬细胞浸润;制备肾脏和肾脏引流淋巴结单细胞悬液,流式细胞术检测ILC2的百分比和绝对计数。为进一步观察IL-33对IRI模型的保护作用,制备重症IRI模型（夹住双侧肾蒂38min）,观察IL-33预处理对小鼠的7d生存率的影响。用Rag1-/-小鼠制备IRI模型,观察清除ILC2对IL-33介导的肾脏保护作用的影响。由于Rag1-/-小鼠不产生成熟的T细胞,可完全排除Treg对实验的影响,术前连续两天给予CD90中和抗体清除ILC2或同等剂量的同型对照Ig G,采用流式细胞术检测肾脏中ILC2,采用PAS染色和血清肌酐评判小鼠肾功能和肾小管损伤。体外扩增ILC2,观察过继性回输ILC2的拯救实验对Rag1-/-小鼠IRI模型的肾脏保护作用的影响。通过流式分选从IL-33处理的C57BL/6小鼠中分离出ILC2,体外用IL-2、IL-7和IL-33培养12d,通过ELISA测量培养上清液中的Areg,IL-4和IL-13,随后将ILC2用CFSE标记后,在双侧IRI手术前1d通过单尾静脉注射将1×10~6的ILC2转移到Rag1-/-小鼠中,实验分为对照组、IRI+安慰剂组、IRI+ILC2组或IRI+ILC2+GW2580组,评估血清肌酐水平和肾小管损伤,通过定量PCR检测肾脏F4/80+肾巨噬细胞中MR、精氨酸酶、HO-1、FIZZ1和IL-10的m RNA表达。使用CRISPR-Cas9敲除了ILC2中的Areg(ILC2Areg-/-),揭示IL-33/ILC2轴介导的肾脏保护作用的分子机制。ILC2Areg-/-体外扩增后,ELISA检测细胞培养上清中的Areg,并将ILC2Areg-/-回输到C57BL/6小鼠制备的IRI模型,评估血清肌酐水平和肾小管损伤;分离肾脏原代肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell,TEC）,在37°C的矿物油中浸泡60min,制备肾缺血再灌注的TEC模型,随后将Areg敲除的ILC2与之共培养,采用流式细胞术检测TEC的细胞凋亡、细胞增殖。制备人源化小鼠IRI模型,观察人IL-33/ILC2轴介导的肾脏保护作用。分离脐带血CD34+HPC,回输NSG小鼠,制备人源化小鼠,在8-12周时用流式细胞术检测肾脏中的ILC2。随后制备人源化小鼠的IRI模型,并假手术组动物用作对照。人源化的NSG小鼠IRI手术之前连续5d每天腹腔内注射0.3μg重组h IL-33,对照组仅接受PBS。IRI手术1d后处死小鼠,检测血清肌酐水平和肾小管损伤评分,使用流式细胞术检测肾脏ILC2的标志性膜分子和比例。分离人PBMC中的ILC2,体外扩增后回输到人源化小鼠IRI模型,1d后处死小鼠,评估血清肌酐水平和肾小管损伤评分。2.ILC210可以延长胰岛同种异体移植物存活制备胰岛移植模型,观察IL-33预处理对胰岛移植物的存活和功能的影响。使用单次静脉注射链脲佐菌素（185mg/kg）使C57BL/6小鼠制备1型糖尿病模型。选择血糖值>16mmol/L的小鼠作为移植宿主,使用非连续梯度离心法Ficoll分离BALB/c小鼠胰岛,将其移植在1型糖尿病模型小鼠的肾下极包膜下,胰岛移植前连续五天向C57BL/6小鼠腹膜内给予0.3μg小鼠重组IL-33或同等体积的PBS,设定一段正常的血糖水平后连续两天血糖升高>16mmol/L为发生移植排斥反应,观察出现移植排斥反应的时间,通过腹膜内葡萄糖耐量测试（IPGTT）来研究体内移植胰岛的功能,胰岛素染色观察胰岛移植物的结构。制备胰岛移植模型,术前连续5d使用IL-33治疗,分别胰岛移植后第7d、30d和80d处死小鼠,使用流式细胞术检测脾脏、肾脏和胰岛移植物中的ILC2比例,使用定量PCR检测胰岛移植物中IL-33、IL-25、TSLP的m RNA表达。使用Treg诱导性缺陷的DEREG小鼠制备胰岛移植模型,观察ILC210在IL-33介导的移植物保护中的作用。IRI术前第2d和第4d,注射DT清除Treg细胞,注射抗CD25抗体（PC61）清除体内ILC2细胞,实验分为对照组、DT、PC61或DT+PC61治疗组,通过监测血糖评估胰岛移植物的存活。体外扩增ILC210,并鉴定其功能。分离肾脏的ILC2,在体外用IL-33和IL-2/抗IL-2抗体复合物（IL-2C）进行扩增,使用ELISA检测上清中的IL-10,流式细胞术检测ILC2细胞中的IL-10和p-STAT5,体外与CD4+T细胞共培养,加或不加IL-10的中和抗体,观察其抑制T细胞增殖的能力。使用CRISPR-Cas9敲除ILC2中IL-10基因（ILC2-IL-10）,观察ILC210细胞对肾脏保护作用的分子机制。ELISA检测细胞上清中的IL-10,用CFSE标记后,分别单独地与ILC210、和non-ILC210静脉回输到胰岛移植模型,通过监测血糖评估胰岛移植存活。制备胰岛移植物模型,观察不同途径回输的ILC210对胰岛移植物保护作用的影响。随后将等数目的ILC210在胰岛移植前1d或者移植后2d通过静脉回输或与移植的胰岛一起局部注射,通过监测血糖评估胰岛移植物的存活时间,通过流式细胞术监测胰岛移植物内的ILC210。结果1.IL-33增强组织驻留型ILC2预防肾缺血再灌注损伤本研究证明用重组小鼠IL-33治疗可以防止缺血-再灌注损伤（IRI）小鼠的肾脏结构和功能损伤,并降低死亡率。与对照组小鼠相比,IL-33治疗的IRI小鼠存活率明显升高,血清和肾脏中不仅IL-4和IL-13水平增加了,而且ILC2数量也增加了,血清肌酐水平降低、肾小管损伤程度明显减轻、中性粒细胞浸润减少。使用中和抗体清除ILC2几乎完全废除IL-33对肾IRI的保护作用。过继性转移体外用IL-33扩增的ILC2可以预防IRI小鼠的肾损伤,敲除Areg可消除ILC2对肾功能和肾小管损伤的保护作用,将ILC2Areg-/-与缺血TEC模型共培养,发现Areg缺失的ILC2共同培养可导致缺血TEC的凋亡增加,这表明来自ILC2的Areg在IRI小鼠的ILC2介导的肾保护中起重要作用。在人源化小鼠模型,小鼠IRI后,用IL-33或ILC2处理也有肾保护作用。此外,在人源化肾IRI小鼠模型中,流式检测发现肾脏存在CD45+Lin-CD127+CD161+CRTH2+人ILC2,分离后用IL-2、IL-7、IL-33培养12d时明显增殖,培养的人ILC2维持关键标志物的表达,并产生大量的Areg和IL-13;过继性回输实验表明,在假手术肾脏和IRI肾脏中均观察到了输注的人ILC2,但是IRI肾脏中的ILC2数量比假手术组肾脏要多。ILC2治疗可显著改善人源化IRI小鼠的肾功能并减轻肾小管细胞损伤,表明离体扩增的人ILC2可有效预防IRI。本研究揭示了IL-33-ILC2轴在肾IRI中的重要保护作用,可作为一种治疗策略加以应用。2.ILC210可以延长胰岛同种异体移植物存活成功建立了胰岛移植模型,使用IL-33预处理,近80%的胰岛移植物存活时间超过80d,而对照组平均生存时间只有12d,IL-33治疗的胰岛移植小鼠胰岛形态保存良好,白细胞浸润减少,葡萄糖耐量显著提高,且葡萄糖曲线下面积（AUC）值显著小于对照组,表现为Th1相关细胞因子IFN-γ和IL-6的血清水平显著降低,而Th2相关细胞因子IL-4和IL-13的血清水平提升以及IL-4和IL-13的表达提高。在Treg缺失的DEREG小鼠中额外耗尽ILC2可完全抵消IL-33的治疗作用,这证明ILC2对于IL-33促进胰岛同种异体移植存活至关重要。本研究还检测了IL-33治疗诱导的ILC210的时空分布,短疗程的IL-33治疗会导致肾脏和胰岛移植物中ILC210的持续增加,而IL-33治疗可导致肾脏和胰岛移植物中ILC2的长期增加,但不会引起脾脏中ILC2的长期增加,免疫荧光显示在胰岛移植物中ILC2的数量多于肾脏和肝脏,这表明ILC2倾向于迁移到经历免疫反应的胰岛移植物中,表明在同种异体移植物中积累的ILC2在IL-33介导的胰岛移植物保护中起关键作用。ILC2滞留时间长于Treg的原因可能与保持胰岛移植物中高浓度的IL-33延长了ILC2的寿命有关。使用DEREG小鼠建立胰岛移植模型,白喉毒素（DT）来选择性地消耗体内的Treg后,用抗CD25抗体治疗可清除体内的ILC2,完全消除了IL-33对胰岛移植的保护作用,这说明ILC2在IL-33介导的胰岛移植物保护中起着关键作用。接下来,本研究检查了IL-2/抗IL-2抗体复合物（IL-2C）和IL-33联合使用显著增加了肾脏中ILC210的数量,体外培养显示IL2C联合IL-33可以促使ILC2分泌更高水平的IL-10。使用CRISPR-Cas9敲除了ILC210中的IL-10,然后ILC210、IL-10-/-ILC210和non-ILC210转移到胰岛移植模型,结果发现在输注了ILC210的小鼠中,胰岛移植物中IL-10的表达显著增加,且显著延长了胰岛同种异体移植的存活时间。通过与CD4+T体外共培养,发现ILC210以剂量依赖的方式有效抑制了同种异体脾细胞诱导的CD4+T细胞增殖,加入IL-10中和抗体减弱了ILC210对CD4+T细胞增殖的抑制作用。此外,另一个重要发现是,ILC210与胰岛一起局部转移对同种异体胰岛表现出比系统转移ILC210细胞更强的保护作用。同样,局部转移的ILC210的表型稳定性是决定胰岛移植物命运的重要因素。这些结果表明同种异体移植物中需要ILC210细胞,以发挥最大的抑制作用和移植物保护作用。总而言之,这项研究揭示了IL-33对同种异体胰岛存活的强大保护作用。IL-33的同种异体移植保护作用取决于其在体内驱动ILC2扩增的能力。此外,这项研究证明了IL-10在ILC2介导的胰岛移植物保护中的重要性。ILC210的局部递送可能是促进胰岛移植物长期存活的最具前途的途径。因此,本研究提出了使用IL-33和ILC210作为辅助疗法来防止同种异体移植排斥的策略,为移植领域带来了新疗法。结论优化了体内外扩增ILC2的方案,揭示了ILC2在急性肾损伤和胰岛移植中的作用机制和治疗潜能;