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朊病毒(Prion)可引起的人和动物的传染性海绵状脑病(Transmissible
Spongiform Encephalopathies,TSE<,s>).该致病因子具有与普通病原微生物不同的理化和生物学特性,至今其致病机理尚不完全明确.该研究利用基因克隆表达和生物信息学技术,结合病理组织学及实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)等方法,在对PrP功能表位分析的基础上,对其主要结构蛋白合成肽的免疫学特性进行了分析,并对PrP重组蛋白脑内接种金黄地鼠的生物学特性进行了探索,为今后进一步研究Prion的致病机理和检测技术奠定了基础,研究内容如下:1.分别成功克隆了奶牛、牦牛、大熊猫、恒河猴、孔雀及珍珠鸡的PrP基因,运用分子生物学软件对其和相关种属PrP基因及氨基酸序列进行了序列比较、遗传进化和同源性分析,对PrP结构蛋白的功能表位及二级结构进行了预测,获得了有关种属间PrP基因结构多态性及功能表位生物学信息,为PRNP基因多态性与朊病毒病的连锁关系研究提供了基础数据.2.利用Goldenkey分子生物学软件分析确定了奶牛PrP的抗原功能表位,化学合成特定序列结构蛋白多肽,经鉴定后按照一定的分子比与载体蛋白匙孔嘁血蓝蛋白偶联,经检测后制备牛PrP多肽兔多抗,并进行了免疫学特性检测.结果表明,所制备的特定表位结构蛋白多肽抗体经ELISA方法测定抗体效价达1:10<8>,经Western blotting试验检测,能够与PrP重组结构蛋白和纯化的牛PrP结合.提示该结构蛋白多肽抗体具有良好的免疫学特性,有望用于TSE检测试剂的研制.3.采用原核表达系统对牛PrP结构蛋白进行了成功表达,并利用结构蛋白多肽抗体进行了鉴定.结果表明:在37℃、OD为0.8时经IPTG(1.0mmol/L)诱导表达3h条件下,重组PrP蛋白的表达量最高.经Western blotting方法检测,表达蛋白与多肽抗体反应性良好.结果提示:该研究成功制备了牛PrP重组结构蛋白,该蛋白有望进一步用作Prion结构生物学的研究材料.4.为了弄清PrP重组结构蛋白的生物致病性及其对PrP基因表达的影响等生物学特性,进而为研究PrP转化为PrP的选择压力条件提供生物学检测方法奠定基础.对试验组6只金黄地鼠脑内注射纯化后的PrP重组结构蛋白(10μg/μl,3μl),对照组2只金黄地鼠用磷酸盐缓冲液(PBS)同法处理,临床观察记录;102天后将实验动物经眼球静脉放血处死,分别取小脑、脑干(Obex部件)、大部分大脑经甲醛固定、制作石蜡切片、H.E.染色,光镜下进行组织病理学观察;取另一部分大脑提取总RNA利用实时荧光定量RT-PCR方法检测不同处理组金黄地鼠PrP表达差异.结果表明:金黄地鼠脑内注射102天内,未见异常临床症状,试验组与对照组无明显差异;未见异常组织病理学变化;试验组和对照组金黄地鼠脑组织PrP基因表达无显著差异.结果提示:通过PrP重组蛋白在检测时间内未能引起地鼠脑组织海绵状病理变化,未能引起PrPmRNA表达水平改变,为进一步研究PrP重组蛋白结构生物学提供了基础数据.