原发性肝癌(primary hepatic carcinoma)是全球导致男性死亡的第三大恶性肿瘤。肝癌(hepatocellular carcinoma)一种高发病率、高死亡率且极难治愈的恶性肿瘤,我国的5年生存率不足5%,肝癌已严重威胁着人类的生命健康,迫切需要研发有效的治疗手段。关于癌症包括肝癌的治疗尝试了很多新的方法,如多种药物联合应用的系统化疗、分子靶向治疗、最近大热的免疫治疗等。其中,与其他癌症疾病一样,分子靶点的治疗仍是肝癌治疗的主要努力方向,但进展缓慢。Gab2(GRB2-associated-binding protein 2)是胰岛素受体底物类似的支架蛋白,能整合多种信号,在信号网络中可能起提纲携领的枢纽作用。我们的前期工作基础发现Gab2是脂肪肝中整合疾病信号的枢纽蛋白,而在肝癌细胞中,Gab2可以促进肝癌细胞的增殖,侵袭和转移,并通过整合Jak2/Stat3信号通路促进肝癌的发生发展。因此,Gab2可能作为一个整合肝癌信号的关键节点,被疾病因素诱导而募集整合多种信号从而促进疾病的发展。肝癌的发生常常涉及一个复杂的机制,针对单一或少量的信号的治疗,治愈效果很差;而针对Gab2这个关键节点就有可能改变多种疾病的信号通路,从而有效逆转疾病的走向。因此,通过有效方法降低Gab2的表达,可能是预防和治疗肝癌的一个有效方法。但遗憾的是目前关于Gab2基因表达的调控机制还不清楚,制约了以Gab2为靶点的肝癌的预防及治疗。因此本课题着力研究Gab2基因转录的调控机制,以期发现其中的关键环节,为研发Gab2的靶向药物提供理论基础。我们首先扩增人Gab2基因启动子区不同长度的截短DNA片段,将其插入pGL6-Basic荧光素酶表达载体中,利用双荧光素酶报告基因系统检测所构建的不同长度片段的启动子活性,确定了在肝癌细胞中Gab2基因转录的核心启动子区域。基于这个转录活性区域,我们利用JASPER,Match和PROMO等生物信息学网站,对Gab2潜在的转录因子结合位点进行预测,发现多个候选转录因子。根据对这些转录因子的评估,我们选择了其中最有可能的转录因子Foxd3(Forkhead box D3)进行了检测。染色质免疫沉淀PCR(ChIP-qPCR)实验结果显示,Gab2启动子能够被Foxd3特异性抗体沉降下来,表明了 Foxd3蛋白能够与Gab2启动子结合。随后我们利用了核苷酸定点突变技术,对Gab2启动子上Foxd3可能的结合位点进行单碱基突变,确定了 Foxd3的核心结合位点;且转录活性分析显示,Foxd3抑制Gab2基因的转录表达。同时这个结果验证了 Foxd3是Gab2基因表达的转录因子,通过结合到启动子上调控Gab2的基因转录。综合上述,本课题从调控Gab2基因转录的转录因子入手,初步揭示了 Gab2基因表达的调控机制,建立了一套研究Gab2表达机制的技术体系,发现了一些有效的候选调控转录因子,为进一步的深入研究奠定了基础。特别是我们初步确认Foxd3是Gab2基因表达的转录因子,不仅证明我们建立的体系是成功可行的,而且对Foxd3调控Gab2进一步的深入研究,也将有可能为通过调控Gab2表达防治肝癌提供可能的途径。