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胰腺癌是最为致命的恶性肿瘤之一,通常在诊断时已处于晚期。唯一的治愈方式是手术切除,但有手术适应症的患者不到一半。患者5年生存率低于1%,且大部分诊断后1年内死亡。因而,寻找用于早期诊断的特异性标志物及用于治疗的特异性分子靶点在胰腺癌的诊治中就显得尤为重要。CacyBP/SIP蛋白(钙周期素结合蛋白、Siah-1相互作用蛋白)最初是用S100A6蛋白从艾氏腹水瘤细胞中捕获并分离纯化的蛋白,随后被证实能够与Siah-1相互作用。后续的研究证实CacyBP/SIP还能够与其它多个蛋白相互结合,如S100蛋白家族(S100A1、S100A12、S100B及S100P),Skp1、Tubulin和ERK1/2[1],从而参与多个细胞生理过程包括蛋白的泛素化降解、细胞分化、细胞骨架重组、肿瘤发生以及通过与这些靶蛋白的相互作用调控转录活动等。我们前期研究发现:与亲本胃癌细胞系SGC7901相比,CacyBP/SIP在胃癌多药耐药细胞系SGC7901/ADR的表达明显上调,提示:CacyBP/SIP的表达上调与胃癌细胞的多药耐药相关。应用我们实验室率先制备的CacyBP/SIP单克隆抗体,我们发现CacyBP/SIP在大部分的肿瘤组织中表达,在胰腺癌,鼻咽癌和骨肉瘤中高表达。这些结果提示CacyBP/SIP可能参与胰腺癌的恶性生物学行为并在胰腺癌的发生发展中发挥一定的作用,但其在胰腺癌中具体功能及可能的分子机制尚不清楚。【目的】1、研究CacyBP/SIP在胰腺癌中的表达与临床病理学特征的关系;2、探讨CacyBP/SIP在胰腺癌中的功能及可能的分子机制。【方法】1、免疫组化分析CacyBP/SIP在胰腺癌组织及正常胰腺组织中的表达,统计学分析其表达与胰腺癌患者临床病理资料之间的关系;2、分别应用RT-PCR和Western-Blot技术分析CacyBP/SIP在新鲜胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;3、构建CacyBP/SIP的小干扰RNA并测序证实;4、将构建的载体质粒转染胰腺癌细胞系PC-2,筛选稳定表达克隆并用RT-PCR和Western-Blot证实;5、分别用MTT实验、克隆形成实验分析CacyBP/SIP对胰腺癌细胞生长能力及克隆形成能力的影响;6、应用裸鼠体内成瘤实验观察CacyBP/SIP对胰腺癌细胞体内成瘤能力的影响;7、流式细胞仪检测转染各种载体的胰腺癌细胞系的细胞周期分布情况;8、应用RT-PCR和Western-Blot筛选细胞周期相关效应分子。【结果】1、CacyBP/SIP在胰腺癌组织的表达明显高于正常胰腺组织免疫组化分析CacyBP/SIP在68例胰腺癌组织和37例正常胰腺组织的表达分布时发现,CacyBP/SIP主要分布于胰腺癌组织的胞浆,较少分布于胞核。68例胰腺癌组织中有28例(41.2%)CacyBP/SIP染色阳性(III、IV级),而在正常胰腺组织中无CacyBP/SIP染色阳性。CacyBP/SIP在胰腺癌组织中的表达要明显高于癌旁组织,具有统计学差异性,(P<0.01)。结果还显示,CacyBP/SIP在胰腺癌组织中的表达水平与肿瘤的分化程度密切相关;TNM分期为III或IV期的胰腺癌组织其CacyBP/SIP的表达水平要显著高于I或II期的胰腺癌组织,具有统计学意义(P<0.01)。另外,CacyBP/SIP在转移与无转移的胰腺癌组织中的表达水平同样具有显著差异(P<0.01)。应用RT-PCR和Western-Blot技术进一步证实,无论是在mRNA水平还是在蛋白水平,手术新鲜切除的胰腺癌组织中的CacyBP/SIP表达要明显高于相对应的癌旁组织。2、体内体外实验证实CacyBP/SIP促进胰腺癌细胞增殖我们构建了两对CacyBP/SIP小干扰RNA (siRNA1、siRNA2),转染低分化胰腺癌PC-2细胞系,两对小干扰RNA均能显著下调PC-2中CacyBP/SIP的表达。Western-Blot和RT-PCR结果显示,siRNA1和siRNA2对PC-2细胞中CacyBP/SIP抑制率分别为90%和75%。转染小干扰RNA的胰腺癌细胞系的细胞生长能力要明显慢于对照组(转染空载体的细胞系),(p<0.05)。我们的结果还显示,下调CacyBP/SIP的表达能够显著降低胰腺癌细胞的克隆形成能力(平板克隆和软琼脂克隆),(P <0.05)。我们接着检测CacyBP/SIP表达水平的变化对裸鼠体内成瘤能力的影响,结果显示,与转染空载体的PC-2/control细胞(对照组)相比,稳定转染两种小干扰RNA细胞形成的肿瘤体积明显小于对照组,具有统计学差异,(P < .05)。Western-Blot检测瘤体中CacyBP/SIP的表达水平,结果提示:CacyBP/SIP在稳定转染siRNA1和siRNA2的PC-2细胞注射形成的瘤体中表达水平明显低于对照组。3、抑制CacyBP/SIP的表达能够阻滞胰腺癌细胞周期进展为了进一步探讨CacyBP/SIP促进胰腺癌细胞增殖的分子机制,我们应用流式细胞术检测下调CacyBP/SIP的表达对细胞周期进展的影响。结果发现:同步化培养24小时后,稳定转染siRNA1和siRNA2的PC-2细胞分别有67.2%和61.4%的细胞处于细胞周期的G1期,而稳定转染pSilencer空载体的PC-2细胞则只有46.3%的细胞处于G1期,具有统计学差异,(P < .05)。为了进一步研究CacyBP/SIP诱导胰腺癌细胞细胞周期进展的机制,我们接着采用Western-Blot方法分析了细胞周期相关效应分子的表达变化情况。结果显示:下调CacyBP/SIP的表达,cyclin A、cyclin E、cdk2和p-Rb蛋白水平表达下调,p27和Rb的表达水平上升,而cyclinB、cyclin D1以及P53等蛋白表达水平未出现明显变化。我们还检测了ERK1/2、Skp1、S100A6以及beta-catenin等被其他研究者证实可以与CacyBP/SIP蛋白相互作用的蛋白的表达变化,结果发现,它们的表达水平在CacyBP/SIP表达变化的PC-2胰腺癌细胞中未发生变化。【结论】1、CacyBP/SIP在胰腺癌组织中的表达要显著高于正常胰腺组织,CacyBP/SIP在胰腺癌组织中的表达水平与组织的分化程度、TNM分期以及是否出现转移呈正相关;2、用小干扰RNA下调CacyBP/SIP的表达可以明显抑制胰腺癌细胞的增殖及成瘤能力;3、抑制CacyBP/SIP的表达可以阻滞细胞由G1期向S期进展,其机制可能是部分通过下调Cyclin A、Cyclin E、CDK2和pRb,上调p27和Rb来实现。