论文部分内容阅读
由马铃薯黑胫果胶杆菌（Pectobacterium atrosepticum）引起的马铃薯黑胫病是各马铃薯产区普遍发生、危害严重的细菌性种传病害。当前对病菌致病基因功能的研究是植物病理学领域的研究热点和焦点，而马铃薯黑胫病菌JG10-08菌株的全基因组测序为该菌致病相关基因功能的验证提供了丰富信息和切入点。本项目利用生物信息学技术预测了endo-PGLI和exo-PGLA的结构与功能，并通过分子生物学技术对其致病基因功能进行了验证。基于P.atrosepticum gyrB种特异性基因序列，建立了实时荧光定量环介导等温扩增(RTFQ-LAMP)分子检测方法。该研究的主要结果如下: 1.预测了endo-PGLI和exo-PGLA的结构与功能:在分析蛋白序列及基本性质的基础上，利用ANTHEPROT5.0软件分析endo-PGLI和exo-PGLA蛋白二级结构，均主要由α-螺旋和β-折叠组成。通过SWISS-MODEL蛋白同源模建数据库构建蛋白三级结构，结果显示，endo-PGLI蛋白的三级结构是一种马鞍状，exo-PGLA蛋白的三级结构是一种扁筒状。利用NCBI中的CDD数据库比对分析保守结构域和功能位点，确定了endo-PGLI氨基酸序列13-568位为周质果胶酸裂解酶家族Pectate_lyase_2保守结构域，exo-PGLA氨基酸序列478-646位为果胶酸裂解酶家族β-折叠保守结构域。endo-PGLI和exo-PGLA均具有降解植物细胞壁果胶成分的致病功能。 2.分别敲除与回复了基因endo-pglI和exo-pglA，获得突变株和回复株:构建自杀载体，利用同源重组双交换原理，敲除了马铃薯黑胫病菌P.atrosepticum野生型菌株JG10-08中目的基因endo-pglI和exo-pglA，获得了两株突变株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA。将目的基因endo-pglI和exo-pglA回复到突变株中，得到回复株△△JG10-08endo-pglI和△△JG10-08exo-pglA。 3.验证了endo-pglI和exo-pglA致病基因功能:用注射法分别将野生型菌株JG10-08和突变株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接种到马铃薯植株茎基部，7天后突变株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接种处周围有轻微的发病症状，其病情指数分别为19.26和20.74;而接种野生型菌株JG10-08的植株茎基部发病严重，接种处出现腐烂症状，其病情指数高达50.37。利用浸泡法分别将野生型菌株JG10-08和突变株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接种马铃薯块茎，7天后，突变株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接种的块茎表面出现了轻微的褐色斑点，病情指数分别为16.30和18.52。野生型菌株JG10-08接种的马铃薯块茎已经开始腐烂，病情指数为47.41。回复株对马铃薯植株和块茎的致病性和野生型菌株相比无显著性差异。这表明endo-pglI和exo-pglA两个基因在黑胫病菌致病性中发挥着重要作用。 4.设计并获得了用于P.atrosepticum RTFQ-LAMP检测的特异引物:基于Pectobacterium属gyrB基因种内保守序列，设计了一套种特异性引物，包括上游外引物(FOP)，下游外引物(BOP)，上游内引物(FIP)，下游内引物(BIP)，上游环引物(FLP)和下游环引物(BLP)。采用8株不同来源P.atrosepticum的菌株和55株近缘种属菌株验证了引物的特异性。 5.建立了实时荧光定量环介导等温扩增方法:优化反应体系中的Mg2+、dNTPs、引物等，确定25μL最佳反应体系为:10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL、10μmol/L的内引物各3.2μL、外引物各0.8μL、环引物各1.6μL、50mmol/L MgSO40.5μL、10mmol/L dNTPs1.5μL、10mol/L甜菜碱1.0μL、8U的Bst DNA聚合酶1.0μL、10000×SYBR GreenⅠ（1∶200稀释）0.3μL、DNA模板2μL和灭菌ddH2O5μL。最佳反应温度为61℃，反应时间为40min。RTFQ-LAMP检测纯培养的P.atrosepticum DNA的灵敏度为58.9fg/反应，其标准曲线显示相关系数为0.9991，相应菌液浓度为3.1CFU/反应;人工添加马铃薯样品中P.atrosepticum的RTFQ-LAMP检出限是2.2×102CFU/g。 6.田间黑胫病实际检测:从田间病株同垄两侧及相邻垄两侧各取2株马铃薯植株，即在病株同垄两侧取420块马铃薯块茎和在病株相邻垄两侧取420块马铃薯块茎进行RTFQ-LAMP检测，病株同垄和病株相邻垄的P.atrosepticum阳性检出率分别为55.2％和36.7％，表明病株同垄比病株相邻垄黑胫病发病严重。从田间无症状植株、发病株及病株周围取马铃薯块茎1260块进行RTFQ-LAMP和普通PCR检测，RTFQ-LAMP P.atrosepticum阳性检出率为47.9％，比普通PCR阳性检出率的32.9％高出15％。且RTFQ-LAMP和普通PCR检测到此批每克马铃薯块茎中P.atrosepticum DNA最低含量分别为0.08ng和0.2ng，表明RTFQ-LAMP方法比普通PCR方法灵敏度高。