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近年来,甲醇型毕赤酵母已经成为重组蛋白生产最重要的宿主菌,因其可以利用甲醇为单一碳源生长。除此之外,甲醇型毕赤酵母还具有严谨的翻译后加工机制、特征的分泌途径、高酶活表达量及可进行高密度发酵等特点,越来越受到科学研究者和工业化的青睐。本论文通过以毕赤酵母作为重组蛋白表达宿主菌,利用不同的表达质粒分别表达了不同种属来源的海藻糖合酶基因,系统的分析了该基因在毕赤酵母中的表达情况。筛选出高表达海藻糖合酶的重组毕赤酵母菌株,利用相应的检测方法实现酶学性质的测定。本论文以提高基因拷贝数为切入点,以期提高酶活。通过利用2A体系构建单启动子双拷贝质粒及筛选多拷贝重组菌两种方法提高基因的拷贝数,并对两组实验结果进行对比。本论文还通过更换、改造AOX1启动子,将其用于海藻糖合酶的表达,同时,在代谢水平过表达中心代谢途径中的关键酶基因提高海藻糖合酶酶活,为工业化奠定基础。具体结果如下：1、本实验选取三种不同来源的海藻糖合酶基因,分别来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,嗜热细菌Thermus thermophilus HB27,海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8,分别与毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZαA,pPIC9k,pGAPZαA以及毕赤酵母胞内表达质粒pPIC3.5k进行连接,构建重组质粒,并转化毕赤酵母,得到12株不同的重组海藻糖合酶毕赤酵母菌株,通过发酵表达及酶活检测,筛选出来源为嗜热细菌Thermus thermophilus HB27,表达质粒为pPIC3.5k的重组毕赤酵母可高效表达海藻糖合酶,酶活最高可达2748.3U。对该来源的海藻糖合酶进行酶学性质的检测,其Km=194.57mM,Vmax=3.68× 10-2mM·S-1,Kcat=223.43S-1,Kcat/Km=1.152S-1·mM-1。2、以拷贝数为切入点,一方面,通过真核表达2A体系构建单启动子双海藻糖合酶基因重组毕赤酵母菌株；另一方面,通过多拷贝重组毕赤酵母筛选不同基因拷贝数菌株,并通过微滴数字PCR测定其绝对拷贝数。对比两种方法,多拷贝子筛选可以得到基因拷贝数为4的菌株,测定酶活可达到3054.1U,酶活提高了11%。3、以启动子为切入点,更换PAOX1为中强组成型PGAP,则可利用葡萄糖为C源进行表达,构建PGAP重组海藻糖合酶毕赤酵母菌株,表达后酶活平均为1363.3U,低于PAOX1水平。因此通过改造PAOX1,得到活性更高的启动子,改造结果为将PAOX1缺失(△-777bp to-712bp)和复制添加(2×-203bp to-190bp)两种改造结合时启动子活性增强,与文献报道一致,将其用于海藻糖合酶的表达,此时海藻糖合酶酶活可达5103.1U,比原始酶活提高了44%。4、重组毕赤酵母生产外源蛋白的同时,势必会对自身的代谢流产生一定影响。本论文通过过表达中心代谢途径：磷酸戊糖途径和TCA循环中关键酶基因,与海藻糖合酶在毕赤酵母中实现共表达。分别共表达ZWF1、SOL3 (PPP途径)、MDH1、GDH3 (TCA途径)这4个基因时,均可提高海藻糖合酶的酶活,当共表达MDH1时,酶表达量较对照组提高20%,酶活达到最高值5680.3U,较对照组提高了11%,较原始组提高了60%。