【摘 要】
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轮状病毒（RV）是仔猪病毒性腹泻的主要致病因子之一,主要感染仔猪小肠成熟上皮细胞,导致其凋亡脱落,肠绒毛萎缩,进而导致吸收不良,引起严重腹泻。丁酸钠（SB）是一种短链脂肪酸类化合物,近年研究表明SB具有一定的缓解细胞凋亡的作用。本研究旨在考察丁酸钠能否通过短链脂肪酸受体GPR109A,缓解RV感染导致内质网应激（ERS）介导的肠道上皮细胞凋亡。本研究包括以下三个试验:试验一RV感染IPEC-J2细
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轮状病毒（RV）是仔猪病毒性腹泻的主要致病因子之一,主要感染仔猪小肠成熟上皮细胞,导致其凋亡脱落,肠绒毛萎缩,进而导致吸收不良,引起严重腹泻。丁酸钠（SB）是一种短链脂肪酸类化合物,近年研究表明SB具有一定的缓解细胞凋亡的作用。本研究旨在考察丁酸钠能否通过短链脂肪酸受体GPR109A,缓解RV感染导致内质网应激（ERS）介导的肠道上皮细胞凋亡。本研究包括以下三个试验:试验一RV感染IPEC-J2细胞引起ERS介导的细胞凋亡试验探究了RV（OSU株）感染对新生仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2凋亡的影响。通过检测细胞活力,DNA片段化,细胞凋亡率,ERS相关通路基因和蛋白表达水平,研究RV感染对IPEC-J2细胞凋亡的影响。试验结果表明:与对照组相比,RV感染呈剂量依赖性的诱导IPEC-J2细胞活力下降（P＜0.05）;10倍感染复数（MOI）RV感染细胞发生明显的DNA片段化现象,显著提高IPEC-J2细胞凋亡率;上调细胞中PKR样内质网蛋白激酶（PERK）,78-k Da葡萄糖调控蛋白（GRP78）,C/EBP同源蛋白（CHOP）,caspase9与caspase3 m RNA水平（P＜0.05）;增加PERK、真核生物起始翻译因子2α（EIF2α）的磷酸化水平和caspase9、caspase3的小片段蛋白水平（P＜0.05）。同时,为了确定RV感染诱导IPEC-J2细胞凋亡通路,本试验进一步通过添加PERK抑制剂GSK,检测ERS诱导凋亡相关的因子基因和蛋白表达情况。结果发现,适宜浓度GSK能显著提高RV感染导致IPEC-J2细胞活力的降低（P＜0.05）;部分阻断RV感染导致Bcl-2 m RNA水平降低,以及caspase9和caspase3 m RNA水平的升高（P＜0.05）;降低了PERK、EIF2α的磷酸化水平和caspase9、caspase3的小片段蛋白水平（P＜0.05）。以上结果表明,RV感染通过PERK/EIF2α信号通路诱导了肠上皮细胞的凋亡。试验二SB对RV感染诱导IPEC-J2细胞凋亡的影响试验研究SB缓解RV感染IPEC-J2诱导的细胞凋亡。首先用不同浓度的SB预处理细胞,检测IPEC-J2细胞24 h耐受SB的浓度范围,结果发现,SB在8 m M以下浓度对细胞无毒性作用。同时检测SB预处理及RV感染后的细胞活力,细胞凋亡率,ERS相关通路基因和蛋白表达水平。试验结果表明:4 m M SB能够显著提高RV感染IPEC-J2的细胞活力（P＜0.05）,降低RV感染诱导的细胞凋亡率（P＜0.05）。与单独RV感染组相比,SB预处理显著降低了PERK,GRP78,CHOP,caspase9与caspase3 m RNA水平（P＜0.05）。以上结果表明SB可通过降低ERS途径相关分子（PERK,GRP78和CHOP）的表达,抑制caspase9,caspase3保护IPEC-J2细胞抵御RV感染诱导的细胞凋亡。试验三SB缓解RV感染IPEC-J2诱导的细胞凋亡的机制试验研究SB是否通过GPR109A抑制RV感染激活ERS引起的细胞凋亡。本试验利用si RNA干扰敲减GPR109A的表达,进而检测细胞凋亡率,ERS相关通路基因和蛋白表达水平。试验结果表明:4 m M SB能够显著抑制RV感染IPEC-J2的GPR109A m RNA水平降低（P＜0.05）;si GPR109A处理,显著提高了细胞凋亡率;增加PERK,EIF2α,激活转录因子-4（ATF4）,GRP78,CHOP,caspase9和caspase3的m RNA水平（P＜0.05）;下调Bcl-2的相对表达量（P＜0.05）;提高了PERK和EIF2蛋白的磷酸化水平以及caspase9,caspase3的小片段蛋白水平（P＜0.05）。结果表明,沉默GPR109A后,SB无法发挥对RV感染诱导的IPEC-J2细胞凋亡的保护作用,进一步证实了SB是通过GPR109A保护IPEC-J2抵御RV感染激活ERS介导的细胞凋亡。综上所述,本研究证实了RV感染IPEC-J2细胞通过PERK/EIF2α信号通路诱导了细胞凋亡;SB可在一定程度上缓解RV诱导的IPEC-J2细胞凋亡,其作用机制是通过上调短链脂肪酸受体GPR109A表达,进而抑制ERS引起的细胞凋亡信号通路。
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