1 前言 大剂量化疗不仅是治疗恶性血液病的基础，更是造血干细胞移植预处理的主要方法。然而，由于化疗药物无明显的组织细胞特异性，会对增值活跃的胃肠道粘膜上皮细胞造成极大的破坏，从而产生粘膜坏死、溃疡，最终使肠道内细菌移位导致内源性感染，甚至败血症。如何有效地减少化疗过程牛胃肠道粘膜的损伤并促进损伤的愈合是目前需要解决的问题。近年来的研究发现胃肠道中存在多种肽类物质参与调控粘膜上皮的生长、更新和修复，其中三叶因子家族中的小肠三叶因子(Intestinal trefoil factor，ITF)与其它可导致细胞分裂增殖的生长因子不同，主要通过促进细胞迁移、抗氧化损伤、抗细胞凋亡和参与调节炎症反应等机制保护肠道粘膜，可能会为胃肠道粘膜损伤的保护和修复开辟新的治疗途径。hITF属低分子多肽，其等电点在4.5～4.9左右，具有耐酸、耐酶和耐热等特性。迄今为止，人们均采用hITF的基因重组产物对其功能进行研究。然而，发生在基因重组产物表达后自然修饰过程的性质尚不明确，hITF在体内的活性形式是单体还是二聚体也无定论。目前，国内外鲜见关于分离天然正常人ITF的正式报道，其主要原因可能在于还没有发现含量丰富且不影响人体安全的组织或其它来源。本研究的合作者林锦教授首先报道了ITF在胚胎发育的中晚期明显增加，其表达水平的 浙江大学硕士掌位论工 高低与胚胎胃肠道发育的正常与否有关——即在正常新生儿的胎粪中可 能存在含量比较丰富的hITF，且胎粪的成分相对比较简单。本研究参照 冷泉港实验室关于从组织中分离钙调蛋白的经典方法，利用hITF的耐 酸特性将其从胎粪中分离并对其生物活性进行初步的研究。 二 材料与方法 2入 蛋白质的鉴定 二．］］总蛋白含量的测定：使用 Coomassie”。P山s蛋白质定量试剂盒，以人 血清白蛋白（＊＊A） 为标准，Bra＊hrd法测定总蛋白含量c 2 12 hlTF抗原性的发色底物法检测：己印迹的硝酸纤维膜门．45pm）用 3％BSA封闭、特异性兔抗人IT’F抗体孵育、碱性磷酸酶标记的二抗 孵育、IStep””NBT／BCIP一步法 显色。 2．13 SDS．PAG电泳及western 印迹：三氯乙酸沉淀法制备电泳样品，改 进型Laemm＊不连续电泳体系恒流恒温电泳分离多肽。用TOwbin转 移缓冲液进行半干恒流转印蛋白，免疫检测hITF 的抗原性并计算相 对分子量。 2二 提取条件的优化： 二二．1 材料收集：收集正常足月新主儿 24小时内徘出的胎粪，于采集后门 个时内进行初步处理。 二二二 酸处理：将每次收集的胎粪随机分为酸处理组和对照组（胎粪总量分 弓为 389 乔 309）。两组在 4℃分别与 0＊ HCI或 Tris·HCI（50 mM， pH 80）匀浆、搅拌 1小时后离心、过滤取上清，检测上清中总蛋白 的含量。 二又3 硫酸按分馏实验：以胎粪u）经0．IN HCI处理、离心、过滤后的 上清为材料，用 NaOH门）调整 pH为 7刀。根据固态硫酸按分级 分离表在上清中加入硫酸铰，使其浓度为30％，4℃搅拌、离心取沉 淀、在上清中继续加入硫酸铰；重复上述步骤，使得硫酸按的浓度依 次为 30％、40％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％和 100％。 各级沉淀物透析后缝隙印迹，硷测hITF的抗原性。 浙江大单硕士学位论文 22．4 等电点沉淀：以经70％硫酸铰（由步骤2二．3确定）沉淀后的上清液 为材料，在 4℃先后进行 2次的等电点沉淀（分别为 pH 4．9和 pH 4．5X 沉淀物经透析后冻干，SDS－PAG电泳、Western印迹、测hITF的抗 原性并计算相对迁移度。 2．2．5 层析条件优化：以等电点沉淀物（sing／ml）为材料。预溶胀的 DEAE七ePhadex A25树脂用由不同PH值和离子强度组合的缓冲液平 衡，4℃孵育1小时，离心取上清缝隙印迹、测hITF的抗原性。 2二石 层析预实验组份分析：等电点沉淀物对层析初始缓冲液（含0．4M NaCI，由步骤2二．5确定）透析。DEAE－Sephadex A25层析柱用初始 缓冲液平衡后加样、洗柱、等量初始缓冲液与限制缓冲液（含1．3M NaCI）连续梯度洗脱，分部收集，分光光度法检测洗脱组份的吸光 度A，s。，并同时检测电导率。洗脱峰各组份缝隙印迹、测hITF抗原 性。 2．3 hITF的提取： 2｝1 材料：实验组为王常足月新生儿24小时内排出的胎粪，共4929，于 采?