目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方尤其是广东省常见的一种恶性肿瘤,俗称“广东瘤”。以调强放疗为主的综合治疗对早期鼻咽癌非常有效,但因其起病隐匿,具有强烈的转移倾向,约75%的患者首诊时就己到达晚期,发生局部淋巴结和/或远处转移,早期诊断是临床一大难题；而治疗后复发或转移则预后极差,成为鼻咽癌治疗失败、生存率下降的主要原因。因此,筛查鼻咽癌的肿瘤标记物,争取早期发现、合理治疗、预测预后、监测复发,对鼻咽癌临床诊治具有极其重要的意义。目前研究发现,鼻咽癌的发病与遗传因素、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)感染以及环境因素密切相关。流行病学调查及病因学研究显示,虽然人群中EB病毒感染具有普遍性,但只有很少一部分个体存在EB病毒特异性IgA抗体阳性,而大部分鼻咽癌患者可检测出EB病毒特异性抗体或EBV-DNA。鉴于鼻咽癌与EBV感染的相关性,现有鼻咽癌的外周血标志物主要围绕EB病毒的相关检查展开,如EB病毒壳抗原抗体VCA-IgA、早期抗体EA-IgA及EBV-DNA。但EBV作为鼻咽癌标志物的敏感性和特异性并不高,在鼻咽癌患者中的EBV阳性率只有60%左右,存在较多的假阳性和假阴性,EBV作为鼻咽癌的标志物远远达不到临床要求。人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen,HLA)被认为是与鼻咽癌发病最显著相关的遗传因素,在鼻咽癌候选基因研究和全基因组关联性研究中均检出HLA与鼻咽癌的存在相关性,HLA的多态性对鼻咽癌发展过程中先天性或获得性免疫反应的激发具有重要的影响作用。此后不同研究团队也纷纷报道不同基因位点与鼻咽癌发病的相关性,理论上证实了基因突变或缺失等遗传因素在鼻咽癌发病中的重要作用,但由于技术和费用等限制,目前还无法应用于临床。其它鼻咽癌相关蛋白及其编码基因标志物的筛选,都止步于实验理论阶段,目前尚无实用的特异性的鼻咽癌标志物。随着研究的深入,研究者发现除了肿瘤相关的蛋白及其编码基因,非编码基因也与肿瘤的发生发展密切相关。特别是一类高度保守的非编码单链小分子RNA(microRNA,miRNA),通过与多个靶基因mRNA的3’非翻译区不完全互补配对,可以在转录后水平抑制基因表达。研究发现50%以上的miRNA定位于肿瘤相关基因组区域,染色体异常直接导致miRNA基因拷贝数的改变,从而造成miRNA在多种肿瘤中表达失调,并发挥癌基因或抑癌基因的作用。在几乎所有肿瘤组织中都检测出异常表达的miRNA,越来越多的研究证实了miRNA几乎参与了肿瘤发生发展中的每一个步骤,在肿瘤发病机制中发挥了超出想象的重要作用,其研究结果发表在《Nature》.《Science》等权威杂志上。特定的miRNA可以反映肿瘤的组织来源,并对其进行分子分型,可用来预测预后及判断治疗敏感性,甚至直接参与肿瘤的治疗。本课题组在前期研究中也发现miR-10b促进鼻咽癌细胞的转移,miR-26a在鼻咽癌组织和细胞中表达下调,并通过调控EZH2,抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭及转移。miRNA可成为肿瘤在临床诊断、分型、治疗选择及预后判断等各方面的分子标志物,存在着不可估量的临床应用前景。2008年《PNAS》报道血循环中miRNA经过长期保存、反复冻融后仍可稳定存在而不发生降解,在肿瘤患者循环中的表达谱与正常人相比存在显著差异,开启了循环miRNA作为肿瘤标志物研究的序幕。循环miRNA作为肿瘤分子标志物具有稳定、易得、高效的优点：miRNA序列保守,在血浆或血清中稳定存在,可长期保存；血样本容易且可反复获得；miRNA检测方法已经逐渐成熟；肿瘤循环miRNA表达谱有明显异常并且有组织特异性趋势,其变化发生早于基因及蛋白,并随着肿瘤的进展而变化。研究显示联合多种血浆miRNA诊断乙肝相关性肝癌,具有比甲胎蛋白AFP更高的诊断效率。相对于肿瘤组织miRNA差异表达的研究,循环miRNA具有易于检测、重复性好的特性,有更好的临床应用前景。为肿瘤的早期诊断、治疗选择、预测预后、随访监测提供了新的思路和方法。由于个体之间的差异,实验方法及标准不同,即使是同一种疾病,同一miRNA范围,各个实验室筛查出的差异miRNA也不尽相同,且循环1niRNA的表达水平在个体之间波动较大,很难界定出一个正常范围,循环miRNA成为真正的肿瘤标记物还面临着许多问题。为了避免个体差异,研究者开始对肿瘤治疗前后血浆IniRNA进行配对比较研究,发现这种配对病例研究更容易筛查得到有意义的肿瘤循环标志物。如食管癌、肺癌、胃癌等实体肿瘤中相关血浆miRNA水平在治疗前后配对比较中有相对一致性变化,并与肿瘤治疗敏感性或复发相关。尽管循环1niRNA已被证实与肿瘤及各种疾病有着千丝万缕的关系,但细胞外miRNA在循环中的存在形式及生理功能尚不明了,目前研究认为循环中miRNA主要由细胞分泌释放入血,以微囊泡(microvesicles,MVs)或蛋白复合体的形式存在,在细胞之间传递生物信息。提示MV或蛋白复合体可能是miRNA的一种载体来传递细胞发出的生物信号,在系统信号通路网络中起着重要的联系和调节作用。鼻咽癌miRNA的研究起步较晚,循环miRNA的研究更是鲜见报道,仅有两篇关于鼻咽癌血清miRNA的临床研究。我们前期尝试对鼻咽癌患者治疗前后血浆miRNA作配对检测,发现治疗后的差异血浆miRNA水平可发生逆转,而在复发转移病例中血浆miRNA差异水平则进一步扩大。血浆miRNA在鼻咽癌诊断和预测治疗敏感性等方面的具有潜在的临床价值。基于miRNA在肿瘤发生发展中的重要作用及循环miRNA在肿瘤临床诊治中的潜在意义,本课题的研究目的是为了全面筛查并验证鼻咽癌血浆中表达差异的miRNA,观察其在鼻咽癌治疗前后或复发时的动态变化,分析探讨血浆miRNA在鼻咽癌早期诊断、预测治疗敏感性及监测复发转移中的临床应用价值,并在鼻咽癌细胞株中观察放疗照射对这些差异miRNA表达水平的影响,以及细胞上清中这些miRNA的存在形式,初步探讨血浆miRNA作为鼻咽癌分子标志物的可行性。材料和方法1.临床病例资料2009年12月～2013年12月在南方医院耳鼻咽喉头颈外科住院的并有完整随访资料及标本的初诊鼻咽癌患者286例,同期住院的排除重大系统性疾病及肿瘤病史的慢性化脓性中耳炎、慢性鼻窦炎患者50例作为非肿瘤对照组。所有病例均经过病理学检查确诊,既往无放疗或化疗史。鼻咽癌组织学分型为非角化性未分化型癌或非角化性分化型癌,依据中华医学会鼻咽癌2008分期进行TNM分期及临床分期。治疗标准参照V.2.2008NCCN鼻咽癌治疗指南进行,全部病人跟踪随访,定期复查。2.血标本收集分离与保存全部患者在治疗前抽取6～8ml EDTA抗凝全血,其中100例鼻咽癌患者在治疗后3月、6月、12月、24月留取血标本。所有患者均签署知情同意书一份。本研究通过美国NIH下属ClinicalTrials.gov临床试验注册审查批准,批准号NCT01171235,并通过南方医院伦理委员会批准。所有标本在4个小时内分离白细胞及血浆后于—80℃低温冰箱保存并由专人负责登记。3.miRNA芯片筛查将20例鼻咽癌及10例正常对照血浆标本委托上海康成生物工程有限公司进行miRNA芯片检测。采用miRCURY Array Power标记试剂盒,将Hy3或Hy5荧光基团标记miRNA,得到用于与芯片杂交的荧光探针,在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY芯片(VVersion16.0, Exiqon, Vedbaek, Denmaik)杂交。选择表达倍数大于1.5且有统计学差异(P<0.05)的miRNA,根据其表达水平进一步筛选作为候选miRNA。4.荧光定量PCR检测抽提血浆或细胞总RNA,逆转录成cDNA后,U6snRNA、miR-634及miR-1228为内参照,ddH20为阴性对照,采用SYBR green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△Ct值代表miRNA的相对表达水平。5.细胞培养人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的RPMI1640培养基,人永生化鼻咽上皮细胞NP69采用KMSF培养基,在37℃、5%C02、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。6. miRNA瞬时转染采用阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按lipofectamineTM2000试剂说明书进行。12孔板中miRNA的转染量为20-80nM。7.细胞放疗实验将鼻咽癌细胞及NP69细胞培养3-4代,待生长状态良好时取106细胞种入6孔板,预实验中设置放射剂量为0、2、4、6、8Gy,照射后继续培养,每隔24h换液,分别在24h、48h后提取细胞总RNA,检测细胞miRNA的表达情况。细胞照射后存活率：细胞照射0、2、4、6、8Gy后48h,每1ml培养基加入0.4%台盼蓝溶液100ul,镜下观察,死细胞被染成明显的蓝色,而活细胞拒染呈无色透明状。每个照射剂量取5个视野,分别计数活细胞和死细胞,活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。8.分离细胞上清exosome鼻咽癌细胞培养3-4代后,接种至10cm培养皿,待细胞状态良好,生长至80%左右换用不含血清的RPMI1640培养基,24-48h后收集培养基上清。采用阶梯超高速离心分离细胞上清exosome,收集沉淀,溶于lml PBS缓冲液,用于下一步实验。9.统计方法采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。数据用均值±标准差。实验中涉及到2组独立样本的比较采用两独立样本t检验；3组或以上独立样本的采用单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步多重比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法。ROC曲线分析血浆miRNA的单独诊断效率,以是否患病为应变量,以8个miRNA表达水平为自变量,进行二分类Logistic回归,建立回归模型,以预测概率与是否患病制作ROC曲线分析多个血浆miRNA联合诊断效率。同一患者治疗前后血浆miRNA的比较采用配对t检验,治疗后多个时间点血浆miRNA的比较采用重复测量的单因素方差分析,两两比较采用LSD法。P<0.05为有统计学意义。结果1.鼻咽癌患者血浆中差异miRNAs筛选及验证应用microRNA芯片对鼻咽癌患者及正常对照血浆进行niRNA全基因组差异表达分析,在1891种miRNA中检测到33种miRNA表达差异(差异倍数>1.5,P<0.05),其中27个高表达,5个低表达。在随后的大样本qPCR验证中,我们检测到8种血浆miRNA在鼻咽癌中表达具有统计学差异,其中miR-9-3p、miR-92a-2-5p、miR-124-3p、miR-892b、miR-3676-3p在鼻咽癌血浆中低表达,miR-214-3p、miR-3135a、miR-4257为高表达(以下均简称为miR-9、miR-92、miR-124、miR-892、miR-3676、miR-214、miR-3135、miR-4257)。其相对正常对照组表达量分别为miR-9(fold change=0.132, t=6.079, P<0.001)、 miR-92(fold change=0.167, t=4.562, P<0.001)、miR-124(fold change=0.125, t=7.732, P<0.001)、miR-892(fold change=0.314, t=3.464, P=0.001)、miR-3676(fold change=0.197, t=4.308, P<0.001)、miR-214p(fold change=3.923, t=-4.834, P<0.001)、miR-3135(fold change=3.888, t=-4.224, P<0.001)及miR-4257(fold change=2.488, t=-5.352, P<0.001)。2.鼻咽癌血浆差异miRNA的诊断价值及与TNM分期及临床分期的相关性采用ROC曲线(受试者工作特征,receiver operating characteristic)分析8个血浆miRNA对于本组鼻咽癌的诊断效率,上述8个血浆miRNA的ROC曲线下面积在0.688至0.782之间,其中miR-9及miR-124的ROC曲线下面积达到0.782,联合8种血浆miRNA可大大提高鼻咽癌的诊断效率,ROC曲线下面积达到0.958,灵敏度及特异度均分别达到0.911及0.867。联合其中5个血浆(miR-9、miR-124、miR-3135、miR-3676及miR-4257) ROC曲线下面积达到0.953,灵敏度及特异度均分别达到0.904及0.867；在早期鼻咽癌中,联合上述5个血浆ROC曲线下面积达到0.919,灵敏度及特异度也可达到0.844及0.867。其中血浆miR-9与T分期呈负相关(F=3.992,P=0.003),随T分期增加,血浆miR-9表达量逐渐下降；血浆miR-9(F=3.663,P=0.014)、miR-92(F=4.571,P=0.004)及miR-892(F=6.071, P=0.001)在不同N分期之间有统计学差异；血浆miR-9(F=5.622, P=0.001)、miR-92(F=4.638, P=0.004)、 miR-124(F=6.560, P<0.001)、miR-892(F=3.102, P=0.029)、miR-3676(F=3.225,P=0.025)及miR-4257(F=3.160,P=0.037)在不同临床分期之间有统计学差异,上述血浆miRNA在高分期患者中较低分期患者表达降低,与临床分期具有相关性。3.鼻咽癌患者治疗前后血浆差异miRNA的动态变化在67例鼻咽癌患者中对比治疗前与治疗后3月血浆差异miRNA的表达变化,miR-9(t=5.068,P<0.001)、miR-124(t=2.833,P=0.006)、miR-892(t=4.544,P<0.001)、miR-3676(t=3.463,P=0.001)在治疗后表达上调,miR-3135(t=-2.229,P=-0.029)在治疗后表达下调,具有统计学差异。对23例患者进行治疗前、治疗后3月、6月、12月不同时间点连续观察上述8种血浆miRNA的动态变化,血浆miR-9在治疗前后各时间点表达具有统计学差异(F=4.256,P=0.018),治疗后表达水平平均升高6.8～14.6倍；血浆miR-124(F=2.959,P=0.039)治疗后各时间点较治疗前表达水平升高2.4～5.4倍；血浆miR-892(F=6.289,P=0.001)治疗后各时间点较治疗前表达水平升高6.7～33.7倍；血浆miR-3135(F=3.175,P=0.03)治疗后表达水平平均降低为治疗前的0.16～0.48；血浆miR-3676(F=4.058,P=0.01)治疗后各时间点较治疗前表达水平平均升高5.7～9.6倍。预示这5种血浆miRNA与鼻咽癌带瘤状态相关,肿瘤治疗消失后向正常水平恢复,6-12月可恢复相对稳定水平。4.鼻咽癌患者复发或转移时血浆差异miRNA的改变8例患者发生复发或转移,在复发转移时血浆miRNA对比治疗前,低表达的miR-9(t=-4.169, P=0.004)、miR-124(t=-4.675, P=0.002)均进一步下调,miR-892(t=-2.886, P=0.023)、miR-3676(t=-2.459, P=0.044)有7例下调,其余4个miRNA则无明显规律。进一步预示miR-9、miR-124、miR-892、miR-3676可能与鼻咽癌病情演变相关。5.鼻咽癌细胞株经放疗照射后miRNA的变化miR-9(F=38.714, P<0.001)、miR-124(F=16.337, P<0.001)、miR-892(F=11.153,P<0.001)在所有5株鼻咽癌细胞中相对NP69都是低表达,其余miRNA无一致性。在5株鼻咽癌细胞中低表达的miR-9、miR-124、miR-892相对照射前均不同程度的上调,其他miRNA变化无一致性。6.瞬时转染miR-892b对鼻咽癌细胞放疗存活率的影响我们选择鼻咽癌细胞照射前后对比NP69变化最大的miR-892b,在瞬时转染miR-892b mimic/inhibitor后,观察其对鼻咽癌细胞照射存活率的影响。转染miR-892b mimic后,5-8F和6-10B细胞在照射8Gy48小时后存活率降低了53%和44%(t=-9.824,P<0.001；t=-4.638,P=0.002)；而转染miR-892b inhibitor后,两种细胞的存活率显著升高,分别提高了55%和65%(t=4.411,P=0.002；t=6.599,P<0.001)。7.鼻咽癌细胞上清exosome中miRNA的表达经过阶梯超高速离心分离细胞上清exosome,在5-8F及6-10B细胞上清中,检测出6种miRNA,其中miR-9、miR-92、miR-124及miR-892在exosome中含量较高,而miR-214及miR-3135则在去除exosome的上清中含量较高,miR-3676及miR-4257则未检出。结论1.8种鼻咽癌血浆miRNA与正常对照比较存在表达差异,其中血浆miR-9、miR-92、miR-124、miR-892、miR-3676表达降低,而血浆miR-214、miR-3135、miR-4257表达增高。2. ROC曲线显示8种血浆差异miRNA指标单独诊断效率均较好,联合5种血浆miRNA (miR-9、miR-124、miR-3135、miR-3676及miR-4257)可显著提高鼻咽癌的诊断效率,并在早期鼻咽癌中也具有较高的诊断效率。血浆miR-9、miR-124、miR-892与鼻咽癌TNM分期及临床分期具有相关性。3.鼻咽癌中低表达的血浆miR-9、miR-124、miR-892及miR-3676在肿瘤治愈后表达增高,而复发时表达降低；而高表达的血浆miR-3135在鼻咽癌治愈后表达降低。这些血浆差异miRNA在治疗前后及复发转移时的动态变化显示了与病情基本一致的变化趋势。4.在鼻咽癌细胞株放疗照射前后,细胞miR-9、miR-124、miR-892的表达变化显示了与血浆miRNA治疗前后一致的变化,瞬时转染miR-892b可影响鼻咽癌细胞放疗存活率。提示miR-892b可能成为鼻咽癌放疗抵抗的标志物。5. miR-9、miR-92、miR-124及miR-892主要是以exosome的形式存在于细胞上清,而miR-214及miR-3135可能以蛋白复合体或其他形式存在。.