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目的：构建五种具有膀胱肿瘤特异性的双启动子重组真核表达载体,每种载体皆包含尿路斑块蛋白2(UroplakinⅡ, UPⅡ)启动子控制的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)、并分别搭配人白细胞介素2(interleukin-2, IL-2).肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing, TRAIL)、融合基因IL-2-TNF-α、融合基因IL-2-TRAIL。方法：以实验室保存的各种质粒为模板通过常规聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction,PCR)分别扩增出UPⅡ启动子及HSV-TK基因、IL-2基因、TNF-α基因、TRAIL基因。用重叠延伸拼接技术将IL-2分别与TNF-α、TRAIL融合为融合基因IL-2-TNF-α(IT)、IL-2-TRAIL(ITR)。以上PCR所得各基因片段分别连接到真核载体pMD18-T并转化至感受态细胞TOP10F’中,摇菌并提取质粒。质粒经PCR和酶切鉴定为阳性后进行测序,测序结果与基因序列同源比较,选取正确的质粒进行载体的构建。用分子生物学技术将双启动子真核表达载体pBudCE4.1的EF-1α启动子替换为UPⅡ启动子形成重组载体pBud-UPⅡ/CMV,转化至TOP10F’后摇菌并提取质粒进行鉴定,鉴定表明替换成功后在UPII后克隆入TK基因形成新载体pBud-UPⅡ-TK/CMV并鉴定。选取鉴定结果为阳性的质粒并在pBud-UPⅡ-TK/CMV的另一启动子CMV启动子后分别克隆入IL-2基因、TNF-a基因、TRAIL基因、融合基因IT、融合基因ITR,从而构建出五种双启动子重组真核表达载体pBud-UPⅡ-TK/CMV-IL-2. pBud-UPⅡ-TK/CMV-TNF-α、pBud-UPⅡ-TK/CMV-TRAIL pBud-UPⅡ-TK/CMV-IT、pBud-UPⅡ-TK/CMV-ITR.五种载体均转化至至感受态细胞TOP10F’中,摇菌并提取质粒,质粒进行PCR和酶切鉴定。结果：成功克隆出UPII启动子以及人白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、融合基因IL-2-TNF-α融合基因IL-2-TRAIL。PCR和酶切的电泳结果显示pBudCE4.1载体中的EF-1α成功地被替换为UPII启动子,说明载体pBud-UPII/CMV构建成功。五种双启动子重组真核表达载体pBud-UPII-TK/CMV-IL-2、PBud-UPII-TK/CMV-TNF-α、 pBud-UPII-TK/CMV-TRAIL、pBud-UPII-TK/CMV-IT、pBud-UPII-TK/CMV-ITR鉴定结果均为阳性。结论：共表达自杀基因联合多细胞因子基因的五种泌尿组织特异性真核表达载体构建成功,为今后在膀胱肿瘤细胞中表达各目的基因,并验证不同基因的抗膀胱肿瘤作用奠定了实验基础。