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奶牛隐性乳腺炎是造成奶牛养殖经济损失的主要疾病之一,主要由金葡菌引起。防治上由于受到药物残留,细菌耐药性等因素制约,疫苗被认为是最有效的手段和措施。CP是金葡菌菌体最外层保护性结构成份,与载体蛋白结合可转变为TD抗原,但这种多糖-载体蛋白疫苗生产成本高,制备工艺复杂。噬菌体表面展示技术,可以将外源多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,同时保持相对独立的空间构象和生物活性。根据这一技术原理,可以利用多糖抗体从噬菌体肽库中筛选出多糖的模拟肽,用来模拟金葡菌CP的糖基表位。根据以上,形成本课题的研究思路:分别对东北地区代表性奶牛养殖场奶牛隐性乳腺炎进行调查,提供CP疫苗研究的依据,分离CP5阳性菌株,提取纯化CP5,制备CP5完全抗原,免疫动物获得针对CP5特异性的多克隆抗体,以多克隆抗体作为工具,从噬菌体环七肽库中反复淘洗筛选阳性克隆,获取CP5的模拟肽,并对模拟肽的免疫原性进行初步验证。目的是为开发金葡菌新型糖基表位模拟肽疫苗提供初步的实验依据。在研究中分别对辽宁沈阳和吉林长春两个奶牛隐性乳腺炎进行了调查,结果隐性乳腺炎发病率分别为34.6和71.6%,其中84.4%和92.7%的隐性乳腺炎是由金葡菌引起。CP5和CP8型CP是优势血清型,这两型金葡菌引起的隐性乳腺炎占全部金葡菌性乳腺炎的75%。选取分离得到的金葡菌菌株,经透射电镜进行形态学鉴定,经免疫学进行血清型鉴定,获得CP5阳性菌株,优选并确定了碳源、培养基种类等生产CP5时金葡菌的培养条件,并在优化培养条件下培养CP5阳性菌株,生产、提取、纯化得到了CP5,利用紫外吸光光谱、化学偶联及HPLC等技术对获得的CP5纯化样本进行了鉴定,之后选择BSA作为载体蛋白,对多糖偶联的反应条件进行优选,制备出CP5-BSA作为完全抗原,免疫小鼠获得了CP5多克隆抗体。用Sepharose 4B制备CP免疫亲和层析柱,纯化得到了抗CP5的多克隆抗体。利用纯化抗CP5多克隆抗体包被酶标板,对噬菌体环七肽库进行了3轮淘洗筛选,将第3轮洗脱下来的阳性噬菌体侵染宿主菌并铺板过夜,随机挑选32个克隆,经ELISA鉴定,其中11个克隆显示与CP5多抗结合较强,提取单链DNA测序结果表明,11个克隆共展示出KTHHREF、FQDPLET、KHVTLDS和TPGWSHE 4个多肽序列,从4个序列中分别挑选1株阳性噬菌体克隆扩增进行小鼠免疫试验,其中展示前3个序列的克隆能够诱导部分小鼠产生抗CP的抗体。。以上实验结果为研究开发金葡菌CP糖基表位模拟肽疫苗,用于防治金葡菌性奶牛隐性乳腺炎,提供了新的研究视角和初步的实验依据。