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生物素是乳制品中众多营养物质之一,参与机体三大营养物质的代谢,是动物机体内不可缺少的一种水溶性维生素。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性,因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。目前,我国现行的检测标准（GB/T 5413.19-1997）.微生物法是唯一检测乳制品中生物素的方法。此法虽然灵敏度高,检出限低,但是该方法操作繁琐,检测周期长,干扰因素多,重复性差的缺点限制了的该方法的应用。因此,迫切需要一种快速、简便、稳定可行、普适性强的方法测定生物素的含量。故此,建立本课题展开这方面的研究。本研究先以基质复杂的配方乳粉为研究对象,通过对生物素的提取条件、固相萃取条件、衍生条件以及液相色谱条件进行重点研究,建立一种可以用高效液相色谱仪对乳制品中生物素进行定性、定量检测的方法,并对此方法进行可行性分析和推广性验证。针对乳制品中生物素的痕量、动态以及基质复杂、干扰物质多等问题,引入了固相萃取（SPE）技术。本文通过对固相萃取条件、衍生条件和液相色谱条件进行优化,得到了较好的实验研究结果。本研究得到的结果如下:1.生物素提取条件的优化确定的最佳超声萃取条件为:50℃×15min;最佳沉淀蛋白条件为:添加0.8～0.9mL 10%HCl溶液。2.固相萃取条件的优化确定的最佳固相萃取条件为:①活化:6mL 100%甲醇,2mL水,5mL 1%的醋酸;②上样:5mL的样品清夜加到柱床上,控制流速在60d/min;③淋洗:5mL 1%的醋酸,2mL去离子水;④洗脱:10mL 100%甲醇。3.衍生反应条件的确定通过对反应温度和反应时间进行比较,确定生物素衍生化反应的最佳条件为:50℃水浴避光反应60min。4.色谱条件色谱柱为BDS HYPERSIL C18（250×4.6mm i.d.5μm）;柱温为50℃;检测器为荧光检测器,检测波长:Ex为340nm,Em为395nm;流动相为水-乙腈,梯度洗脱（洗脱程序见表3-2）;流速1mL/min;进样量10μL;分析时间35min。5.SPE-HPLC（FLD）方法检测乳制品中生物素的方法学评价对所建立的SPE-HPLC检测乳制品中生物素的方法进行方法学评价,包括:精密度、稳定性、灵敏度及回收率等。样品的日内、日间精密度试验的RSD值均小于3%,具有较好的精密度;生物素的最低检出限为25ng/mL;固相萃取回收率和方法回收率均为:90～100%;衍生物24h内稳定,线性范围为25～300ng/mL,相关系数为0.9996。本文对市场上多种奶粉、原料粉、原料奶和婴儿米粉等进行了推广性验证分析,结果表明此方法实用、可行。所建立的方法和传统的微生物法相比,方法操作简单,快速,选择性强,能克服传统方法中繁琐,重现性低等缺陷和不足。截至目前,这些都是首创。这在痕量生物素的精确定量方面不仅具有非常重要的理论意义,而且具有广大的应用前景。