缺血性脑梗死是由动脉阻塞引起的缺血性损伤。大脑中动脉为缺血性脑梗死最常见的阻塞动脉[1]。血栓形成后导致通过颅外和颅内系统的血流量减少,循环功能主要靠侧支循环进行维持。当侧支循环的补偿机制失效时,脑灌流会受到影响,导致灌注减少和细胞死亡[2]。缺血性脑梗死初期,细胞储存能量的丧失导致细胞内外离子平衡和细胞毒性神经递质的调节紊乱及血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的破坏,引起神经炎症反应。在此过程中血脑屏障破坏是神经炎症反应起始、蔓延及神经细胞损伤恶化的主要原因[3]。因此,及时修复BBB,恢复脑血流可以防止脑组织的进一步损伤。BBB主要由血管内皮细胞、周细胞和星形细胞终足构成[4]。在中央神经系统(central nervous system,CNS)的BBB中,内皮细胞被周细胞紧密包围并共用一层基底膜,两种细胞通过N-cadherin、缝隙连接和紧密连接相连[5]。在生理条件下,BBB的选择性通透作用严格限制血液中炎症细胞、炎症因子及神经毒性物质浸入CNS,同时将CNS中代谢物质排出脑外,进而维持脑组织微环境稳态,是CNS神经功能正常发挥的基础[6]。由于对氧压敏感度高,在缺血性脑梗死发生后周细胞首先脱落,随后伴有内皮细胞紧密连接破坏导致通透性增加,脑组织水肿进而引起神经炎症反应[2]。包括溶栓和手术在内的临床脑梗死治疗方法中,尚未存在针对缺血性BBB损伤修复的治疗方法。因此,干细胞疗法因其多细胞分化能力及细胞因子分泌作用成为缺血性脑梗死治疗的主要候选疗法[7,8]。在干细胞多种来源中,骨髓干细胞由于体外培养中容易收集和快速拓展等优点,广泛应用于缺血性脑梗死的治疗[9]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植至缺血性脑梗死动物模型后,通过细胞因子分泌间接促进局部血流量[10],减少了神经细胞凋亡[11],促进血管生成[9];同时移植后的MSC存在于血管周围,表达周细胞表面标记物,极少一部分移植后的MSC表达神经细胞的特异性标记物[10]。内皮前驱细胞(endothelial progenitor cell,EPC)移植至缺血性脑梗死动物模型后,促进对内皮细胞的保护修复作用[12],并促进血管生成[13]。但是单独应用MSC或EPC的临床试验中并没有成功得到预期的结果,主要原因包括以下两方面:单一干细胞类型移植不能满足缺血性脑梗死引起的BBB多细胞损伤修复的需求[14];周细胞低迁移及血管覆盖率[15]。因此在本实验中应用MSC针对BBB中的周细胞;EPC针对BBB中的内皮细胞成分。然而血脑屏障的重建并非是单纯两种细胞的共培养。BBB重建过程主要包括由血管生成相关因子VEGF等诱导的管腔形成,由周细胞募集因子PDGF-BB参与的周细胞迁移,最后由连接蛋白N-cadherin介导的内皮细胞与周细胞粘附。为了进一步优化MSC和EPC对BBB的修复作用,我们加入了神经肽P(substance P,SP)。SP是一种具有相似药理特性和保守羧基末端序列的神经肽家族的成员之一[16]。其受体Neurokinin-1 receptor(NK-1R)广泛分布于免疫细胞、内皮细胞、神经和神经胶质细胞以及本实验中应用的MSC和EPC。在生理情况下,SP的作用主要包括调节NO的分泌及血管通透性。研究表明,SP在缺血性疾病中促进血管生成[17,18],同时SP在体外MSC培养实验中增强了其免疫调节作用[19]。我们前期工作首先确定了SP通过促进骨髓MSC移植至外周血,最终到达损伤部位并促进组织的修复及再生[20]。SP在骨髓源性MSC和EPC共培养条件下是否发挥作用的相关研究,目前尚未报道。本实验在体外共培养和缺血性脑梗死体内移植两方面,研究SP对MSC和EPC的作用及其机制。为缺血性脑梗死的干细胞治疗提供新的方向。一、SP对体外MSC和EPC共培养下成管能力的影响方法1.MSC和EPC的分离和鉴定:分离骨髓原代MSC和EPC;利用免疫荧光检测MSC特异性标记物α-SMA、CD29和EPC特异性标记物UEA-1、CD31及CD34;利用流式细胞术检测MSC特异性标记物NK-1R、CD29、CD106、CD45及CD34。2.SP对体外MSC、EPC及共培养MSC和EPC成管能力的影响:利用成管实验在不同时间点分别检测SP对MSC、EPC及共培养MSC和EPC成管能力的影响;利用荧光检测MSC和EPC在成管实验中的定位关系。3.SP促进体外共培养MSC和EPC成管能力的作用机制:(1)SP对成管相关因子的影响:ELISA法检测VEGF及PDGF-BB的分泌;Western-blot法检测连接蛋白N-cadherin的表达。(2)SP受体NK-1R拮抗剂对PDGF-BB分泌的影响:ELISA法检测NK-1R拮抗剂处理后PDGF-BB的分泌。(3)PDGF-BB对SP处理共培养MSC和EPC成管能力的影响:利用体外成管实验检测PDGF-BB功能性中和抗体处理后共培养MSC和EPC成管能力;利用细胞免疫荧光技术检测MSC和EPC成管结构中的定位关系。结果1.MSC和EPC的分离鉴定:获得大鼠骨髓原代分离的MSC和EPC;MSC高表达特异性标记物α-SMA、CD29、NK-1R及CD106;低表达CD45及CD34;EPC高表达特异性标记物UEA-1、CD31和CD34。2.SP对MSC和EPC成管能力的影响SP处理MSC 3h对成管能力无明显作用;SP处理EPC 1.5h开始至3h明显增加EPC成管管壁长度;共培养MSC和EPC促进MSC似周细胞样向管内迁移、覆盖;SP处理共培养MSC和EPC明显促进两种细胞共同成管能力、增加成管长度、支点数量及MSC向管内迁移数量。3.SP促进共培养MSC和EPC成管能力的作用机制(1)SP对成管相关因子的影响:SP处理明显增加共培养MSC和EPC VEGF、PDGF-BB和连接蛋白N-cadherin表达。(2)SP受体NK-1R拮抗剂对PDGF-BB分泌的影响:SP受体NK-1R拮抗剂处理后,PDGF-BB分泌量明显降低。(3)PDGF-BB功能性中和抗体对SP处理共培养MSC和EPC成管能力的影响:PDGF-BB功能性中和抗体处理后,明显减少MSC向管内迁移及覆盖。体外实验结论:SP通过增加PDGF-BB分泌促进MSC向成管结构迁移,上调连接蛋白N-cadherin的表达水平并最终促进两种细胞共同成管能力。二、SP在MSC/EPC共移植治疗大鼠缺血性脑梗死中的作用方法:1.缺血性脑梗死动物模型的制作及动物筛选缺血性脑梗死大鼠模型;通过阻塞大鼠大脑中动脉建立缺血性脑梗死大鼠模型,利用局部脑血流检测及动物行动学筛选实验动物。2.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死功能恢复的影响利用行动学分析检测缺血性脑梗死大鼠功能恢复;利用MAP2免疫组化染色方法检测梗死范围。3.SP对MSC和EPC缺血性脑梗死移植后迁移作用的影响(1)SP对MSC和EPC迁移的影响:利用体内追踪Dye D标记的EPC、荧光追踪PKH绿色标记MSC及红色标记EPC检测迁移路线和移植效率。(2)MSC与神经胶质细胞的位置关系:免疫荧光染色法检测GFAP阳性神经胶质细胞与PKH标记MSC的位置关系及BBB结构的相似性。4.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死BBB的影响利用免疫组化染色法检测BBB标记物SMI71,量化SMI71阳性面积检测脑梗死周围组织BBB的密度、长度及半径变化。5.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死炎性调节及神经细胞的影响利用免疫组化染色检测星形胶质细胞标记物GFAP及活性巨噬细胞标记物CD68;利用免疫组化染色检测神经元标记物Neu N及增殖细胞标记物PCNA在梗死周围及室下区的表达。结果1.缺血性脑梗死动物模型的制作、鉴定及样品筛选大鼠经大脑中动脉阻塞缺血性脑梗死模型制作后,病侧脑局部血流减低大于对侧40%,同时神经学分数在5到10范围内的大鼠被选为后续实验动物。2.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死行动学恢复的影响SP与MSC和EPC共移植后,明显促进缺血性脑梗死大鼠行动学恢复、增加神经细胞标记物MAP2阳性范围及明显减少梗死面积。3.SP对MSC和EPC缺血性脑梗死移植后迁移作用的影响(1)SP对MSC和EPC迁移的影响:荧光追踪显示,移植至对侧的MSC和EPC通过胼胝体迁移至病侧;SP在移植早期促进MSC向病侧迁移;晚期促进MSC似周细胞样血管覆盖。体内追踪EPC显示,SP促进EPC向病侧迁移(2)MSC与神经胶质细胞的位置关系:PKH标记MSC与GFAP阳性神经胶质细胞共定位于血管周围,形成与BBB类似的结构。4.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死BBB的影响SP与MSC和EPC共移植,明显增加梗死周围SMI71阳性BBB血管密度、长度及BBB阳性血管半径。5.SP对MSC和EPC共移植后缺血性脑梗死炎性调节及神经生成的影响SP与MSC和EPC共移植后,CD68阳性活性巨噬细胞数量明显减少,脑梗死周围组织GFAP阳性神经胶质细胞形成的胶质瘢痕明显减少、梗死周围组织Neu N阳性神经细胞及室下区PCNA阳性细胞数量明显增多。体内实验结论:共移植SP与MSC和EPC,促进缺血性脑梗死大鼠行动学恢复;促进MSC和EPC向对侧的迁移;增加缺血性脑梗死周围组织BBB数量及长度;抑制炎症反应以及促进神经生成。